Утверждены

Минздравом СССР

31 августа 1973 г. N 1112-73

27 сентября 1978 г. N 1914-78

19 октября 1979 г. N 2067-79

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ БМК И БЕНЛАТА ПО БМК В РАСТИТЕЛЬНЫХ

ОБЪЕКТАХ, ВИНЕ, ПОЧВЕ И ВОДЕ МЕТОДОМ

ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>

 

--------------------------------

<*> Разработаны: К.Ф. Новиковой, Л.И. Лещинской (ВНИИХСЗР) [1]; Г.И. Крамаренко (ВИЛР); В.А. Сигаевой (Институт биофизики) [2]; Н.В. Бажановой, К.В. Аветисян (АрмНИИЗР) [3].

 

    Краткая  характеристика препарата. Бенлат (фундазол, беномил, Д-1991) -

системный   фунгицид,  рекомендуемый  для  борьбы  с  грибковыми  болезнями

растений   (парша,  серая  гниль  и  т.д.).  Действующее  начало  препарата

N-(1-бутилкарбамидобензимидазолил-2)-O-метилкарбамат.        Брутто-формула

C  H  NO . Молекулярная масса 290,0. В чистом виде - белые кристаллы, т. пл.

 14 18  3

290  °C  (с разложением). Практически нерастворим в воде, плохо растворим в

органических растворителях. В пищевых продуктах растительного происхождения

МДУ  0,5  мг/кг,  в  сахарной  свекле, пшенице 1 мг/кг. В растениях, воде и

почве бенлат быстро гидролизуется до БМК.

    БМК (бавестин, карбендазим, БАС-346) - системный фунгицид с аналогичной

бенлату  областью применения. Действующее начало препарата - метиловый эфир

2-бензимидазолилкарбаминовой кислоты. Брутто формула C H N O . Молекулярная

                                                      9 9 3 2

масса  191,3. В   чистом   виде -  белые   кристаллы,   т. пл. выше 300 °C.

При  300 °C  возгоняются   с  разложением, которое  начинается  при 230 °C.

Растворимость  в  100  г  растворителей  при  20  °C,  г:  для воды - 0,01;

этилового спирта - 0,04;  ацетона - 0,03;  циклогексана - 0,001;  бензола -

0,001; хлороформа - 0,01.  В  сахарной  свекле  МДУ  0,1 мг/кг. В  огурцах,

яблоках,  винограде,  землянике,  черной   смородине   содержание   БМК  не

допускается.

Принцип метода. Метод основан на извлечении бенлата и БМК из анализируемых объектов этилацетатом, очистке экстракта перераспределением в соляную кислоту, а затем, после подщелачивания раствора, в этилацетат и определении БМК методом ТСХ.

Метрологическая характеристика метода. Предел обнаружения в хроматографируемой пробе: на УФ пластинках - 3 мкг [1]; 5 мкг при проявлении пластинки бромфеноловым реагентом [2]; 10 мкг при проявлении пластин фосфорно-молибденовой кислотой [3|. Предел определения в исследуемых объектах, мг/кг: арбузы, яблоки, огурцы - 0,1; семена хлопка, льна - 0,2; семена мака, шиповника, в подорожнике - 0,3; в почве - 0,15; воде - 0,02; в вине - 0,1 мг/л. Среднее значение определения стандартных количеств бенлата и БМК при n = 15 во всех объектах - 80,0%. Стандартное отклонение при n = 15 +/- 7,1%. Доверительный интервал среднего при p = 0,95 и n = 5 80 +/- 9%. Размах варьирования для всех объектов 70,0 - 90,0%.

Избирательность метода. Метод селективен. Цирам, цинеб, ТМТД, каптан и другие определению не мешают.

    Реактивы  и  материалы.  Ацетон  х.ч.  Хлороформ свежеперегнанный, х.ч.

Этилацетат  свежеперегнанный,  х.ч.  Этиловый спирт,  96-процентный. Гексан

х.ч. Циклогексан х.ч.  Аммиак, 30-процентный раствор. Гидроксид натрия 4 н.

Безводный  сульфат  натрия х.ч.  Хлороводородная  кислота,  0,1 н  раствор.

Ледяная    уксусная   кислота.    Фосфорно-молибденовая   кислота   ч.д.а.,

1-процентный   раствор  в   этиловом   спирте.   Нитрат   серебра   ч.д.а.,

1-процентный.  Бромфеноловый  синий  ч.д.а.,   0,05-процентный   раствор  в

ацетоне.  Проявляющий  реагент:  1-процентный  водный раствор азотнокислого

серебра  и  0,05-процентный  раствор  бромфенолового  синего  смешать перед

употреблением  (1:1).  Лимонная кислота,  2,5-процентный раствор. Пластинки

"Силуфол"  УФ   .  Стандартный раствор БМК в ацетоне с  содержанием  100  и

             254

10 мкг/мл. Раствор стабилен при хранении в холодильнике 6 мес.

Приборы, аппаратура, посуда. Аппарат для встряхивания. Ротационный вакуумный испаритель. Кофейная мельница. Почвенное сито. Лампа УФ-света типа "Хроматоскоп" или аналогичная с диапазоном излучения 250 - 260 нм. Воронки делительные на 500 и 1500 мл. Колбы: конические на 250 мл; круглодонные на 250 мл; грушевидные на 50 мл; плоскодонные на 500 мл; мерные на 100 мл. Мерные цилиндры. Центрифужные пробирки на 10 мл; градуированные с оттянутым кончиком; пипетки на 10; 5; 1 и 0,1 мл.

Подготовка к определению. Хроматографические камеры заполняют системами подвижных растворителей за 1 ч до начала хроматографирования для насыщения парами растворителей.

Ход анализа. Экстракция и очистка экстракта. Образец из огурцов, яблок, арбузов с помощью ножа измельчают на кусочки размерами 0,5 x 0,5 x 0,5 см, отбирают среднюю пробу 30 г. Навеску пробы помещают в коническую колбу на 250 мл, заливают 100 мл этилацетата и экстрагируют фунгицид с помощью механического встряхивания в течение 30 мин. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в делительную воронку на 500 мл. Экстракцию повторяют еще 2 раза этилацетатом порциями по 75 мл. Из объединенного экстракта БМК извлекают реэкстракцией 0,1 н HCl 3 раза по 50 мл. Объединенный солянокислый экстракт дважды промывают гексаном порциями по 30 мл. Гексановый слой отбрасывают. К солянокислому раствору добавляют 4 мл 4 н раствора едкого натра (до pH 10) и трижды экстрагируют БМК этилацетатом порциями по 50 мл. Этилацетатный экстракт сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют в круглодонную колбу вместимостью 200 мл и с помощью ротационного вакуумного испарителя полностью отгоняют растворитель.

Пробу из семян хлопка, льна, зерна [1] измельчают с помощью кофейной мельницы до размера частиц, равных размеру частиц манной крупы. Навеску в 15 г помещают в плоскодонную колбу на 250 мл, заливают этилацетатом (100 мл), а затем проводят экстракцию БМК и очистку экстракта, как указано для огурцов.

Пробу вина (30 мл) помещают в делительную воронку на 300 мл и трижды экстрагируют БМК этилацетатом порциями по 50 мл. Дальнейшую очистку экстракта проводят по схеме, описанной для огурцов.

Пробу подорожника, семян мака, плодов шиповника [7] массой 10 г измельчают (кроме мака), заливают 100 мл этилацетата и экстрагируют на аппарате для встряхивания в течение 1,5 ч. Добавляют безводный сульфат натрия и отфильтровывают через бумажный фильтр в делительную воронку. Промывают растительную пробу 2 раза этилацетатом порциями по 50 мл и отфильтровывают в ту же делительную воронку. Экстрагируют БМК трижды 0,1 н раствором соляной кислоты порциями по 50 мл. Объединенный солянокислый раствор 2 раза промывают петролейным эфиром (т. кип. 70 - 100 °C) порциями по 50 мл. К солянокислому раствору добавляют 4 н раствор едкого натра до pH 10. Далее поступают так, как описано для огурцов.

Просеянную через почвенное сито почву [1] растирают в ступке, отбирают навеску в 20 г, переносят ее в колбу на 500 мл, тщательно увлажняют водой (5 мл), а затем заливают 100 мл этилацетата и экстрагируют БМК с помощью механического встряхивания в течение 1 ч. Экстракцию повторяют еще 2 раза этилацетатом порциями по 50 мл. Каждую порцию экстракта фильтруют в делительную воронку, и дальнейшее определение проводят по схеме, описанной для огурцов.

Воду (1 л) помещают в делительную воронку на 1500 мл, добавляют около 30 г NaCl, затем по каплям - 4 н едкий натр до pH 10 и экстрагируют БМК этилацетатом порциями один раз по 100 мл и 2 раза по 50 мл [1]. Дальнейшую очистку объединенного экстракта проводят по схеме, описанной для огурцов.

    Хроматографирование.  Сухой остаток после удаления растворителя смывают

количественно с помощью 2 - 3 мл ацетона в пробирку с оттянутым кончиком. В

пробирку  помещают  заплавленный  сверху  стеклянный  капилляр  и упаривают

ацетон,  нагревая  пробирку на горячей водяной бане до объема около 0,1 мл.

Остаток с помощью того же капилляра, но с отломанным  заплавленным  концом,

наносят  на  хроматографическую пластинку. Параллельно на пластинку наносят

серию  стандартных  растворов  БМК  с  содержанием 3; 4; 5; 6; ...; 10 мкг.

Хроматограмму   развивают   либо  в  системе   этилацетат-хлороформ-ледяная

уксусная  кислота  (50:50:10),  либо в  системе  толуол-этилацетат-этиловый

спирт-аммиак (60:10:20:2). БМК проявляется при облучении пластин под лампой

УФ-света  в  виде  синих флюоресцирующих пятен на желтом фоне с R  в первом

                                                                 f

случае  0,37 +/- 0,02,  во втором - 0,47 +/- 0,01.   Для  проб  вина  можно

использовать  лишь  вторую  систему,  так  как  в  первой  на  уровне   БМК

присутствуют  пятна  неизвестных коэкстрактивных веществ. Линейный диапазон

определения 3 - 10 мкг. Пятна стабильны несколько месяцев [1].

    Экстракты подорожника,  мака и шиповника [2] хроматографируют в системе

хлороформ-ацетон-циклогексан-уксусная  кислота   (7:1:2:1),  R   БМК в этой

                                                              f

системе  0,38 +/-0,02.  Если хроматограмму развивали на пластинке "Силуфол"

без флюоресцентной добавки, то хроматограмму обрабатывают из пульверизатора

1-процентным  спиртовым  раствором  фосфорно-молибденовой  кислоты.   После

выдерживания  пластинки в течение 15 мин.  под УФ-светом  БМК проявляется в

виде  желтовато-белых   пятен  на  бледно-голубом   фоне.   Нижний   предел

определения 10 мкг в пробе [3].  Линейный диапазон определения 10 - 20 мкг.

Хроматограмму на пластинке "Силуфол" без флюоресцентной добавки можно также

обрабатывать  после  нагревания в сушильном  шкафу при температуре 100 °C в

течение  5 - 10 мин.  смесью  азотнокислого серебра с бромфеноловым синим и

после  2 - 5 мин.  нагревания в сушильном шкафу  снимают фон 2,5-процентным

раствором лимонной кислоты.

На хроматограммах БМК проявляется в виде синих пятен на лимонном фоне [2]. Линейный диапазон определения 5 - 10 мкг.

Обработка результатов анализа. Содержание БМК в пробе (X, мг/кг или мг/л) вычисляют по формуле:

 

                                      A

                                  X = -,

                                      P

 

где:

A - количество БМК, найденное в хроматографируемой пробе методом соотношения со стандартами, мкг;

P - навеска или объем исследуемой пробы, г или мл.

Требования безопасности. Необходимо соблюдать правила безопасности, рекомендуемые для работы с легковоспламеняющимися жидкостями.