Утверждаю

Заместитель Главного

государственного

санитарного врача СССР

А.И.ЗАИЧЕНКО

28 января 1980 г. N 2146-80

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ФДН (N',N'-ДИМЕТИЛ-N-(3-ХЛОРФЕНИЛ)-ГУАНИДИНА)

В ОГУРЦАХ, БАХЧЕВЫХ И ВОДЕ МЕТОДОМ

ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

 

Настоящие Методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских учреждений Минздрава СССР, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Минсельхоза СССР и лабораторий других министерств и ведомств, занимающихся анализом остаточных количеств пестицидов и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде.

Методические указания апробированы и рекомендованы в качестве официальных группой экспертов при Госкомиссии по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками при МСХ СССР.

Методические указания согласованы и одобрены отделом перспективного планирования санэпидслужбы ИМПиТМ им. Е.И. Марциновского и лабораторным советом при Главном санитарно-эпидемиологическом управлении Минздрава СССР.

 

1. Краткая характеристика препарата

 

Активное вещество ФДН - N',N'-диметил-N-(3-хлорфенил)-гуанидина

Структурная формула:

 

       ---          CH          ---         CH

     //   \\       /  3       //   \\      /  3

     \ ___ / NH-C-N     ----> \ ___ / N=C-N

       ---      || \    <----   ---     |  \

     Cl         NH  CH        Cl        NH  CH

                      3                   2   3

 

    Эмпирическая формула: C H  N Cl.

                           9 12 3

    Молекулярная масса: 197,67.

    Температура плавления: 132 °C.

    В чистом виде ФДН - кристаллы белого цвета. Хорошо растворим в ацетоне,

диэтиловом  эфире,  бензоле,  хлороформе, метаноле. Плохо растворим в воде,

петролейном эфире. ЛД   для крыс 438 мг/кг.

                     50

ПДК в огурцах, арбузах, дынях и воде не установлена.

Выпускается в виде 50-провентного смачивающегося порошка. Помимо активного вещества, ФДН состоит из 2% ДП-7, 3% ССБ и 45% трепела.

Применяется в практике сельского хозяйства для борьбы с мучнисторосяными грибами, поражающими огурцы, бахчевые и другие культуры.

 

2. Методика определения ФДН в огурцах, арбузах, дынях и воде

методом тонкослойной хроматографии

 

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Метод основан на извлечении ФДН из огурцов, арбузов и дынь ацетоном с последующим перераспределением фунгицида в соляную кислоту, а затем после подщелачивания раствора - в бензол. Из воды после подщелачивания ФДН извлекают диэтиловым эфиром или хлороформом. Очистку экстрактов и конечное определение проводят двумерной хроматографией.

Обнаружение зон локализации ФДН производят реактивом Драгендорфа (сорбент - окись кремния для люминофоров, окись алюминия) либо по реакции диазотирования ФДН (после термического разложения) нитритом натрия в солянокислой среде с последующим азосочетанием солей фенилдиазония с альфа-нафтолом (сорбент - окись алюминия). Зоны локализации ФДН могут быть проявлены также в УФ-свете (лямбда = 253 нм, лампа "Хроматоскоп" или аналогичная, пластинки "Силуфол-254").

Количественное определение производится путем сравнения интенсивности окраски и размера пятен пробы и стандартных растворов.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

Нижний предел обнаружения ФДН с помощью реактива Драгендорфа - 1,0 - 1,5 мкг; по реакции диазотирования и азосочетания - 0,5 - 0,8 мкг; с помощью УФ-облучения - 0,3 - 0,5 мкг.

Нижний предел определения препарата в воде - 0,001 мг/л (сорбент - окись кремния для люминофоров) и 0,02 мг/л (сорбент - окись алюминия), в огурцах, арбузах, дынях - 0,05 мг/кг (сорбент - окись кремния для люминофоров) и 0,2 мг/кг (сорбент - окись алюминия).

Размах варьирования, средний процент определения заданных количеств пестицида, стандартное отклонение, относительное стандартное отклонение, доверительный интервал среднего приведена в таблице N 1.

 

Таблица N 1

 

 

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА

 

┌───────────────┬───────────────────────────────────────────┬───────────────────────────────────────────┐

│    Объекты    │                    Вода                   │           Огурцы, арбузы, дыни            │

│ исследования  │                                           │                                           │

├───────────────┼──────────────┬────────────────────────────┼───────────────┬───────────────────────────┤

│Метрологическая│Окись кремния │       Окись алюминия       │ Окись кремния │      Окись алюминия       │

│характеристика │     для      │                            │      для      │                           │

│               │ люминофоров  │                            │  люминофоров  │                           │

│               ├──────────────┼─────────────┬──────────────┼───────────────┼─────────────┬─────────────┤

│               │              │C = 0,1 мг/л │C = 0,25 мг/л │               │C = 0,4 мг/кг│C = 1,0 мг/кг│

├───────────────┼──────────────┼─────────────┼──────────────┼───────────────┼─────────────┼─────────────┤

│Размах         │70 - 95% = 25%│95 - 30 = 15%│95 - 76 = 19% │70 - 100% = 30%│90 - 70 = 20%│85 - 66 = 19%│

│варьирования   │              │             │              │               │             │             │

│Средний %      │80,0%         │89%          │88,6%         │85,0%          │78,0%        │77,6%        │

│определения    │              │             │              │               │             │             │

│Стандартное    │8,0%          │8,9%         │9,8%          │10,0%          │7,4%         │6,7%         │

│отклонение     │              │             │              │               │             │             │

│Относительное  │10,0%         │10,0%        │11,0%         │11,8%          │9,0%         │8,0%         │

│стандартное    │              │             │              │               │             │             │

│отклонение     │              │             │              │               │             │             │

│Доверительный  │80,0 +/- 10,3%│89 +/- 11,8% │88,6 +/- 13,0%│85,0 +/- 12,9% │78,9 +/- 9%  │77,6 +/- 8,9%│

│интервал       │              │             │              │               │             │             │

│среднего       │              │             │              │               │             │             │

└───────────────┴──────────────┴─────────────┴──────────────┴───────────────┴─────────────┴─────────────┘

 

 

2.1.3. Избирательность метода

Определению ФДН не мешают диурон, монурон, пропазин, арезин, амибен, пикуран, теноран, паторан, пирамин, триазин, прометрин, семерон, атразин, симазин, ГМК.

Определению ФДН могут мешать азотосодержащие соединения, имеющие величину Rf, близкую Rf ФДН.

2.2. Реактивы и растворы

Алюминия окись II степени активности, МРТУ 6-09-5296-68.

Аммиак, х.ч., ГОСТ 3760-64.

Ацетон, х.ч., ГОСТ 2603-71.

Бензол, ГОСТ 5955-75, ос.ч.

н-Гексан, ТУ 6-09-3375-73, свежеперегнанный.

Висмут основной азотнокислый, ГОСТ 10217-62.

    Гипс (кальций сернокислый CaSO  х 2H O) в течение  2 суток  прокаливают

                                  4     2

при 180 °С и просеивают через сито 100 меш.

Метанол, х.ч., ГОСТ 6995-67.

Натр едкий, 4 Н р-р, ГОСТ 4328-66.

Натр сернокислый безводный, ГОСТ 4166-76.

Натр азотистокислый.

Калий йодистый, ГОСТ 3210-66, ч.д.а.

Кислота соляная, ГОСТ 3118-67, х.ч., отн. пл. 1,19, 0,1 Н р-р.

Кислота серная, ГОСТ 4204-66, отн. пл. 1,84, х.ч., 40-процентный и 20-процентный растворы.

Окись кремния для люминофоров, ГОСТ 9428-60.

Спирт этиловый, ГОСТ 5963-67.

Хлороформ, х.ч., ГОСТ 200-15-74.

Этилацетат, ГОСТ 5-1070-71.

Эфир диэтиловый (для наркоза), Фармакопея СССР.

альфа-нафтол.

Проявляющий реактив N 1 (реактив Драгендорфа).

850 мг азотнокислого висмута растворяют в 40 мл дистиллированной воды, приливают 10 мл 40-процентного р-ра серной кислоты и раствор, содержащий 8 г йодистого калия в 20 мл воды. Из полученной смеси берут 6 мл, приливают 6 мл 20-процентного р-ра серной кислоты.

Проявляющий реактив N 2. К смеси, состоящей из 46 мл дистиллированной воды и 4 мл конц. соляной кислоты, прибавляют 1 г азотистокислого натрия.

Проявляющий реактив N 3. 3 г едкого кали растворяют в 50 мл дистиллированной воды, прибавляют 0,5 г альфа-нафтола.

Стандартный раствор ФДН (концентрация 500 мкг/мл). 2,5 мг ФДН (х.ч.) растворяют в ацетоне в мерной колбе на 50 мл.

Стандартные растворы ФДН в ацетоне с содержанием 100 мкг/мл (I) и 10 мкг/мл (II). Для приготовления стандартного раствора (I) в мерную колбу емкостью 100 мл взвешивают 10 мкг ФДН. Содержимое колбы растворяют в 20 мл ацетона, а затем доводят до метки тем же растворителем. Для приготовления раствора (II) из раствора (I) пипеткой отбирают 10 мл, переносят в мерную колбу емкостью 100 мл и доводят до метки ацетоном.

Стандартные растворы ФДН при хранении в холодильнике стабильны в течение 3-х месяцев.

2.3. Посуда и приборы

Аппарат для встряхивания, МРТУ 2451-64.

Баня водяная, ТУ 64-1-2850-76.

Воронки химические, диаметр 6 см, ГОСТ 86-13-64.

Воронки делительные, емк. 250, 500 мл, ГОСТ 10054-75.

Испаритель вакуумный ротационный, МРТУ 42-2589-66.

Камера для опрыскивания, ТУ 11-430-70.

Камера для хроматографирования размером 150 х 200 мм.

Колбы мерные, емк. 50, 100 мл, ГОСТ 1770-74.

Колбы н/ш, емк. 100, 250 мл, ГОСТ 10394-63.

Колбы круглодонные н/ш, емк. 150, 200 мл, ГОСТ 10394-72, емк. 20 мл.

Лампа УФ-света типа "Хроматоскоп" или аналогичная (лямбда max = 253 нм).

Микропипетка, ГОСТ 1770-74 (для нанесения стандартного раствора).

Пластинки стеклянные размером 13 x 18 см.

Пипетки, емк. 1, 5, 10 мл, ГОСТ 1770-74.

Пульверизатор стеклянный.

Ступка фарфоровая.

Сито капроновое, размер отверстий 70 - 90 меш.

Цилиндры мерные, емк. 25, 50, 100, 250 мл, ГОСТ 1770-74.

2.4. Подготовка к определению

2.4.1. Приготовление пластинок

Стеклянные пластинки тщательно моют раствором хромовой смеси, промывают проточной водой, затем дистиллированной и сушат.

Адсорбенты просеивают через сито (70 - 90 меш).

Пластинки, покрытые тонким слоем окиси алюминия, готовят следующим образом. Взвешивают 50 г окиси алюминия и 5 г гипса, смешивают с 70 мл дистиллированной воды, взбалтывают. Полученную массу равномерно наносят на 8 - 10 пластинок.

Пластинки, покрытые окисью кремния, готовят следующим образом. 12 г сорбента и 1 г гипса тщательно растирают в ступке, затем добавляют 50 мл дистиллированной воды при постоянном помешивании массы. Полученную сорбционную массу равномерно наносят на 4 пластинки.

Сушат пластинки в течение суток при комнатной температуре, хранят - в специальных стеллажах закрытого типа.

2.4.2. Подготовка проб

Из партии огурцов (10 шт.), арбузы, дыни (3 шт.), подлежащих анализу, отбирают среднюю пробу (25 - 50 г), измельчают.

2.5. Проведение определения

2.5.1. Экстракция

Вода. Пробу анализируемой воды (200 - 1000 мл) помещают в делительную воронку, подщелачивают NaOH (4 Н) до pH = 10 - 11, экстрагируют ФДН тремя порциями диэтилового эфира по 50 мл (либо хлороформом) в течение 3 - 5 мин. каждый раз, объединяют экстракты, фильтруют через слой безводного сернокислого натрия и упаривают до нескольких капель (~ 0,05 мл). Остаток наносят на пластинку с тонким слоем сорбента.

Огурцы, арбузы, дыни. Навеску огурцов, арбузов, дыни (25 - 50 г) помещают в плоскодонную колбу емкостью 500 мл, добавляют 2 мл 0,1 Н соляной кислоты и 75 мл ацетона. ФДН экстрагируют из анализируемых объектов при помощи механического встряхивателя в течение 30 мин. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в круглодонную колбу емкостью 300 мл. Экстракцию ацетоном повторяют еще дважды, порциями по 75 мл. Объединенный экстракт упаривают с помощью ротационного вакуумного испарителя до объема 3 - 5 мл, раствор переносят в делительную воронку емкостью 50 мл, колбу смывают 0,1 Н соляной кислотой порциями три раза по 5 мл. Смыв также переносят в делительную воронку. Объединенный экстракт промывают гексаном 3 - 5 порциями по 10 мл (до получения бесцветного гексанового слоя). Верхний, гексановый слой отбрасывают. В ацетоновый слой добавляют 0,5 мл 4 Н NaOH до pH - 10, после чего ФДН трижды экстрагируют бензолом, порциями по 10 мл. После разделения слоев водный слой отбрасывают, а объединенный бензольный экстракт сушат над безводным сульфатом натрия. Высушенный раствор порциями фильтруют в грушевидную колбу емкостью 20 мл, из которой отгоняют растворитель с помощью ротационного вакуумного испарителя до объема 1 мл, затем добавляют свежую порцию фильтрата. Последнюю порцию растворителя отгоняют до объема 0,1 - 0,2 мл.

2.5.2. Хроматографирование

Подготовленный и сконцентрированный экстракт при помощи стеклянного капилляра количественно с помощью ацетона переносят на хроматографическую пластинку, покрытую тонким слоем сорбента (окись кремния для люминофоров, окись алюминия либо пластинки "Силуфол-254"). Справа от пробы наносят стандартные растворы ФДН микропипеткой в количестве 10 - 20 мкл, что соответствует 5 - 10 мкг (С = 500 мкг/мл) либо 0,05 - 0,1 мл, что соответствует тем же количествам препарата (С = 100 мкг/мл). Для нанесения меньших количеств препарата используют стандартный раствор (С = 10 мкг/мл).

Точки нанесения пробы, стандартных растворов, направления хроматографирования приведены на рис. 1 (не приводится).

Производят двумерное хроматографирование. При анализе воды I фаза - хлороформ. Сушат пластинку. Поворачивают ее на 90° и хроматографируют во второй фазе. II фаза - этилацетат + ацетон + аммиак = 5:1:0,4 (Rf = 0,54 +/- 0,05) либо ацетон + гексан + этиловый спирт + аммиак = 8:1:3:0,4 (Rf = 0,40 +/- 0,05) - сорбент: окись кремния для люминофоров.

При использовании окиси алюминия в качестве сорбента для тонкослойных хроматограмм II фаза - этилацетат + аммиак = 18:0,4 (Rf ФДН = 0,55 +/- 0,05) либо этилацетат + метанол + вода = 8:1:1 (Rf = 0,30 +/- 0,05).

При использовании пластинок "Силуфол-254" II фаза - этилацетат + аммиак = 8:6 (Rf = 0,68 +/- 0,05).

При анализе огурцов I фаза - диэтиловый эфир + этилацетат = 1:1. II фаза такая же как и при анализе воды.

После окончания хроматографирования пластинку сушат и обрабатывают реактивом N 1 (реактивом Драгендорфа). При наличии ФДН появляются красные пятна на светло-желтом фоне.

Возможен другой способ проявления хроматограмм. После окончания хроматографирования пластинку помещают в сушильный шкаф, нагревают при 170 - 180 °С 30 - 40 мин. После охлаждения пластинку обрабатывают реактивом N 2 (нитрит натрия в солянокислой среде), затем реактивом N 3 (раствор альфа-нафтола в щелочной среде). При наличии ФДН появляются красные пятна на белом фоне.

Вышеуказанные способы обнаружения ФДН возможны в слое окиси кремния для люминофоров и в слое окиси алюминия.

Обнаружение зон локализации ФДН на пластинках "Силуфол-254" достигается при облучении их УФ-светом (лямбда = 253 нм). ФДН проявляется в виде сиреневых флуоресцирующих пятен на зеленом флуоресцирующем фоне пластинки.

2.6. Обработка результатов анализа

Количественное определение производится путем сравнения площади пятен проб и стандартных растворов. Измерение площади осуществляется с помощью миллиметровой бумаги. Пропорциональная зависимость между площадью пятна и концентрацией препарата наблюдается до 10 мкг. При большем содержании на пластинку наносят часть раствора.

Содержание препарата в анализируемой пробе в мг/л либо мг/кг (X) рассчитывают по формуле:

 

                                    A х S

                                         2

                                X = ------,

                                    P х S

                                         1

 

    где:

    A - количество мкг стандартного раствора препарата;

    S  - площадь пятна стандартного раствора, кв. мм;

     1

    S  - площадь пятна пробы, кв. мм;

     2

    P - масса или объем пробы, взятый на анализ в г или мл.

2.7. Требования техники безопасности

Соблюдать требования безопасности, обычно рекомендуемые для работы с органическими растворителями, УФ-светом, концентрированными кислотами.

2.8. Настоящая методика разработана авторским коллективом: ВНИИ химических средств защиты растений, г. Москва, К.Ф. Новикова, И.Л. Меерзон, Т.В. Алдошина, А.А. Морозова. ВНИИГИНТОКС, г. Киев, М.А. Клисенко, Н.И. Киселева, С.И. Гнед.