Утверждаю

Начальник Главного управления

карантинных инфекций МЗ СССР

В.П.СЕРГИЕВ

19 февраля 1980 года

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

К КОНТРОЛЮ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ПО БИОЛОГИЧЕСКИМ ПОКАЗАТЕЛЯМ

 

ВВЕДЕНИЕ

 

Комплексная система стандартизации медицинских биологических препаратов, в том числе и бактериологических питательных сред, предусматривает применение унифицированных методов оценки качества готовых препаратов промышленного изготовления, а также экспериментальных образцов на различных этапах их конструирования и испытания.

В настоящих "Методических рекомендациях" на основе обобщения опыта по контролю питательных сред промышленного изготовления предлагаются: условная классификация бактериологических питательных сред; биологические показатели, используемые для оценки сред; рекомендации для выбора той совокупности показателей, которые необходимы для оценки конкретной питательной среды в соответствии с ее назначением; описание методик оценки по всем показателям и необходимой подготовительной работы с тест-штаммами.

Изложенными рекомендациями необходимо руководствоваться на этапе конструирования бактериологических питательных сред, при последующих их испытаниях (авторских, комиссионных), а также при серийном промышленном выпуске препаратов с внесением унифицированных методов на соответствующих этапах в программы испытания и в техническую документацию.

Данные рекомендации могут быть использованы и для оценки качества питательных сред лабораторного изготовления.

 

КЛАССИФИКАЦИЯ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

 

По своему целевому назначению питательные среды можно условно разделить на две основные группы: диагностические и производственные.

 

I. Диагностические среды

 

Эта группа сред, в свою очередь, включает следующие подгруппы:

1. Среды для выращивания широкого спектра микроорганизмов (жидкие, плотные) с целью одноразового посева или длительного культивирования.

2. Среды для выделения конкретного вида возбудителя (плотные элективные, селективные).

3. Среды дифференциальные, позволяющие различать отдельные виды (группы) микроорганизмов (плотные элективные, содержащие индикаторы, красители и т.д.).

4. Среды для идентификации, позволяющие по отдельным признакам (отношение к углеводам, мочевине и др.) проводить идентификацию микроорганизмов.

5. Среды накопительные - для обогащения конкретного вида микроорганизмов (жидкие, полужидкие элективные, селективные).

 

II. Производственные среды

 

К данной группе могут быть отнесены питательные среды, используемые в производственном процессе получения медицинских биологических препаратов (бактерийных вакцин, анатоксинов и др.) и контроле их качества.

Поскольку для получения производственных питательных сред более целесообразным является использование не готовых сухих сред, а сухих компонентов коммерческого изготовления (белковые основы, стимуляторы роста и др.), в данное руководство включена именно эта группа препаратов:

1. Белковые основы (пептоны, гидролизаты и т.п.), стимуляторы роста (дрожжевые и другие экстракты).

2. Среды для контроля качества препаратов (стерильность).

 

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ,

ПРИМЕНЯЕМЫЕ ДЛЯ ОЦЕНКИ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

 

Оценка питательных сред и их компонентов проводится с помощью совокупности показателей <*> из числа нижеперечисленных, выбираемых для контроля среды в соответствии с ее назначением:

    1.  Чувствительность определяется по максимальному разведению культуры,

при  котором  на  всех  засеянных  чашках  (пробирках) обнаруживается рост.

                                                            -1     -9

Результат  указывается  по  соответствующему  разведению (10   - 10  )  для

всех групп питательных сред <*>.

--------------------------------

<*> Для каждого показателя указаны N (согласно N в разделе "Классификация") тех групп препаратов, для оценки которых данный показатель является обязательным.

 

2. Эффективность - по выходу микробных тел с 1 мл питательной среды (в млрд./мл) - для группы I/5 и II/1.

3. Показатель стабильности основных свойств микроорганизма - по отношению числа атипичных по морфологии, биохимическим, серологическим, фаголизабельным и др. свойствам колоний к общему числу колоний на чашках с испытуемой средой (в %) - для всех групп, кроме II/2.

4. Дифференцирующие свойства - по выраженности отличительных признаков патогенных микробов от непатогенных видов и естественных ассоциантов (по структурным особенностям колоний, их окраске, изменению цвета и др. признакам) - для групп I/3, I/4.

5. Показатель ингибиции - по степени подавляющего воздействия на постороннюю микрофлору. Выражается либо кратностью того минимального разведения, при котором полностью отсутствует рост посторонней микрофлоры, либо величиной отношения числа сформировавшихся клеток тест-штамма к расчетному количеству посеянных при соответствующем разведении клеток - для всех сред I группы, кроме I/1, I/4.

6. Скорость роста - по минимальному времени инкубации после посева культур, достаточному для их выявления (выражается в часах), - для всех групп питательных сред.

 

ОЦЕНКА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ПО БИОЛОГИЧЕСКИМ ПОКАЗАТЕЛЯМ

 

Тест-штаммы культур, порядок хранения

и подготовка для контроля

 

Набор тест-штаммов для оценки соответствующей питательной среды авторы определяют в процессе экспериментальной работы и рекомендуют их для контроля после проведения этапа испытания образцов питательной среды.

Рекомендуемые для контроля свежевыделенные штаммы с момента выделения и получения их в виде чистых культур не должны проходить более 3 - 5-ти последовательных пересевов на питательных средах с последующим (обязательным) лиофильным высушиванием в большом количестве ампул и представлением в ГИСК для хранения в качестве производственных штаммов.

Используемые для контроля музейные тест-штаммы получают в лиофилизированном состоянии из ГИСК им. Тарасевича.

Лиофилизированные музейные и свежевыделенные культуры хранят при Т 4 - 6 °C.

Восстановление культур из лиофилизированного состояния проводится с использованием жидкой <*> и плотной питательных сред, принятых для определенной группы микроорганизмов.

--------------------------------

<*> В случае отсутствия первичного роста культуры на плотной среде необходимые исследования проводят с бульонными культурами.

 

Рекомендуемые для контроля штаммы должны проверяться на отсутствие диссоциации по соответствующим тестам (см. ниже). В случае необходимости проводят изучение культурально-морфологических и биохимических свойств. Тест-штаммы должны находиться в типичной для данного микроорганизма форме. В случае, если обнаруживается более 25% полиморфных колоний, культура не может быть использована для контроля питательных сред.

Восстановленную культуру пересевают на соответствующую среду хранения, после чего пробирки запаивают. Полученные таким образом исходные культуры тест-штаммов хранят при Т 4 - 6 °C и используют по мере необходимости.

Для получения рабочей культуры исходную культуру тест-штамма из запаянной пробирки высевают на такое количество пробирок с соответствующей средой для последующего хранения, которое позволит обеспечить необходимый контроль питательной среды. Рабочую культуру хранят при Т 4 - 6 °C не более 3 - 6 месяцев в условиях, предохраняющих культуру от высыхания. Для посева на испытуемые среды используют культуры тест-штаммов, прошедшие не более 2-х пассажей на питательных средах.

 

Проверка тест-штаммов на диссоциацию

 

а) Визуальный просмотр колоний на чашках и в микроскопе в "косонаправленном" свете.

б) Проба кипячением 2-х млрд. взвеси микробных тел агаровой культуры в физиологическом растворе на водяной бане в течение 1 часа (учет результатов и агглютиноскопа). Взвесь культуры должна быть гомогенной.

в) Эмульгирование агаровой культуры на стекле в 0,85% и в 4% растворах NaCl, а также в растворе трипофлавина 1:1000 (для культур, не содержащих поверхностных К-антигенов). Культура не должна хлопковаться.

г) Специфическая реакция агглютинации на стекле с адсорбированными агглютинирующими специфическими сыворотками. Реакция агглютинации должна быть не менее чем на 3+.

 

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ

И СКОРОСТИ РОСТА

 

Культуры тест-штаммов, выращенные на скошенном агаре, смывают физиологическим раствором NaCl и подводят под оптический стандарт ГИСК им. Тарасевича, соответствующий 10 ед. мутности. В тех случаях, когда не определен коэффициент пересчета микробных клеток в единицы мутности, расчеты ведут от 10 ед. мутности по соответствующему разведению.

Из исходной стандартной взвеси готовят 10-кратные разведения путем последовательного переноса не менее 0,5 мл культуры в 8 пробирок с 4,5 мл физиологического раствора, тщательно перемешивая и меняя стерильную пипетку после каждого "шага".

                                     -5    -6    -7    -8

    Из  4-х  последних разведений (10  , 10  , 10  , 10  ) по 0,1 мл взвеси

из  каждого вносят в 3 хорошо подсушенные чашки (пробирки) с плотной средой

или 3 пробирки с 10 мл жидкой (полужидкой) питательной средой <*>.

    --------------------------------

    <*> При посеве  в  жидкие  (полужидкие)  питательные  среды  обогащения

                                    -4    -5    -6    -7

посевы производят  из  разведений 10  , 10  , 10  , 10    по  1  мл  взвеси

в каждую пробирку с 9 мл среды.

 

При посевах на чашки и пробирки с плотной средой взвесь культуры распределяют по поверхности среды, используя для каждой чашки новый шпатель, а на пробирках со скошенным агаром взвесь культуры распределяют путем обкатывания. Метод обкатки можно использовать и для чашек. Посевы помещают в соответствующие условия выращивания.

После инкубации производят учет результатов, чувствительность среды определяют по наибольшему разведению, обеспечивающему формирование колоний или визуально видимый рост на всех засеянных чашках (пробирках) с питательной средой <*>.

--------------------------------

<*> При определении показателя чувствительности в жидких средах обогащения в случае отсутствия визуально обнаруживаемого роста после соответствующей инкубации посевов из каждой пробирки производят высев на чашки с питательным агаром, разделенным на 4 - 8 секторов, на каждый из которых засевают по одной петле культуры из каждой пробирки с жидкой средой.

 

Учет результатов скорости роста культуры в каждом взятом в опыт разведении микробной взвеси производят для плотных сред через 12 - 24 - 48 часов инкубации, для жидких (обогащения) - через 3 - 6 и далее часов. Показатель скорости роста определяют по минимальному времени инкубации посевов, за которое при соответствующем разведении обеспечен отчетливый видимый невооруженным глазом рост культуры (помутнение, наличие пленки, осадка, роста по уклону и др.) во всех засеянных пробирках с жидкими (полужидкими) питательными средами или формирование типичных, легко дифференцируемых колоний на чашках (пробирках) с плотной средой.

 

Определение стабильности биологических свойств культур

 

Определение этого показателя проводят на чашках, где выросло не менее 25 и не более 100 - 150 колоний. Изучают свойства культур, выращенных на питательных средах, по культурально-морфологическим, биохимическим, серологическим, фаголизабельным и другим признакам. При этом оцениваются:

а) характер роста культур (равномерное помутнение среды, формирование пленки на поверхности среды, придонно-пристеночный рост, рост в виде осадка и др. в жидких средах. Равномерное, зональное помутнение среды, рост по уколу, сталактитовый рост, в виде елочки в др. - в полужидких средах; форма, структура, характер роста колоний, диаметр (измеряется с помощью микрометра или циркуля-измерителя, средний диаметр вычисляется из 5-ти измерений на каждой чашке. Диаметр колоний в популяции не должен отличаться более чем в 2 раза) - на плотных средах);

б) морфология микробов - форма (кокки, палочки, отсутствие полиморфизма в размерах, окраске и др.):

- расположение (одиночное, парное, гроздевидное, цепочки и др.);

- строение (наличие капсулы, жгутиков, спор, включений и др.);

- подвижность;

в) серологические признаки изучают в реакции агглютинации на стекле с видовыми (рецепторными) агглютинирующими сыворотками, с антительными диагностикумами или с люминесцирующими сыворотками, с антительными диагностикумами или с люминесцирующими адсорбированными сыворотками. Проверяют физико-химическое состояние клеток - стабильность взвеси микробов (отсутствие спонтанной агглютинации) в растворе трипофлавина, в 0,85% и 4% растворах NaCl;

    г)  биохимические  свойства  (ферментация  углеводов, образование H S и

                                                                       2

индола и др.), пигментообразование;

д) фаголизабельность;

е) биологические свойства (гемолиз и др.).

Названные свойства определяют по общепринятым методикам. По п. п. "в", "г", "д" изучают не менее чем 3 колонии с каждой чашки.

 

Определение дифференцирующих свойств

 

Дифференцирующие свойства среды определяют по следующим тестам:

а) выраженности дифференцирующего признака - структура колоний, изменение цвета колоний или цвета среды под колониями, ореол вокруг них, диаметр последнего, появление диффузного изменения цвета среды;

б) четкости дифференциации колоний группы патогенных микроорганизмов от микробов непатогенных видов, входящих в тот же систематический таксон, и от естественных ассоциантов при посеве смесей.

Для оценки дифференцирующих свойств среды готовят смесь из штамма каждого возбудителя и одного из штаммов непатогенных микробов. Испытывают два варианта смесей патогенного и непатогенного микробов в отношении 1:1 и 1:10. Высев из каждой смеси производят по 0,1 мл на 3 чашки с опытной средой. Первая смесь необходима для учета четкости дифференциации, вторая - для оценки возможности выделения единичных патогенных возбудителей из смеси с другими микроорганизмами.

Дифференцирующие свойства сред, используемых для идентификации чистых культур, определяют качественно набором штаммов с положительными и отрицательными признаками по соответствующим тестам.

 

Определение показателя ингибиции

 

Ингибирующие свойства среды определяются как по отношению к патогенной флоре, так и по отношению к микробам-ассоциантам.

При определении показателя ингибиции в отношении микробов-ассоциантов посевная доза этих микробов должна превышать посевную дозу патогенной флоры в 10 раз для слабо элективных и в 100 раз (и более) для селективных сред. Смесь готовится путем соединения 1 мл взвеси, содержащей в посевной дозе 100 микробных клеток возбудителя, и 1 мл взвеси одного из микробов-ассоциантов, содержащего 1000 и 10000 м.к. Из указанных смесей производят высев по 0,1 мл на 3 чашки (каждый штамм смешивается с патогенным возбудителем отдельно).

Ингибирующее действие жидких селективных (элективных) питательных сред обогащения определяют по отношению к патогенной и к соответствующей непатогенной микрофлоре с использованием монокультур и их смеси. С этой целью по 1 мл взвеси, содержащей 10, 100 и 1000 м.к. чистой культуры патогенного, 1000, 10000 м.к. (и более) чистой культуры непатогенного микробов, вносят в три параллельные пробирки (с 10 мл среды) каждого разведения. Одновременно в 3 пробирки с 10 мл испытуемой среды вносят это же количество микробных клеток патогенного возбудителя в смеси с 1000, 10000 и 100000 м.к. непатогенного микроба. Через 3 - 6 и более часов инкубации производят высев из каждой пробирки с посевами чистых культур и из смесей по 0,1 мл на чашки с соответствующей средой для последующей идентификации и через оптимальный срок инкубации учитывают результат (аналогично тому, как для плотных сред).

 

Определение показателя эффективности

 

а) Оценку качества белковых основ по показателю эффективности на моделях жидкой питательной среды производят путем определения концентрации микробной взвеси в среде через соответствующий срок инкубации по изменению показателя оптической плотности (на спектрофотометре или ФЭКе).

б) На модели плотной питательной среды эффективность определяют по следующей методике: 18 - 20-часовую культуру смывают с плотной среды физиологическим раствором хлористого натрия и взвесь доводят до 10 ед. оптического стандарта мутности ГИСК им. Тарасевича. Полученную взвесь разводят физиологическим раствором в 2 раза, что соответствует приблизительно 500 млн. микробных тел в 1 мл (5 ед. стандарта). 0,1 мл этого разведения засевают на 2 пробирки со скошенным испытуемым агаром (скашивают таким образом, чтобы в нижней части пробирки не было столбика). Через 20 часов роста при 37 °C культуры смывают с поверхности агара 2,5 мл физиологического раствора. Добавление физиологического раствора, которое пошло на это разведение, плюс 0,5 мл взвеси культуры в физиологическом растворе и составят выход микробных тел (в млрд.) с 1 мл среды.

Пример:

2,5 мл физиологического раствора смывают культуры с 5 мл питательного агара. Следовательно, на 1 мл питательного агара приходится 0,5 мл взвеси культуры. Для разведения 0,5 мл взвеси культуры до содержания 1 млрд. микробных тел (10 ед. стандарта) пошло 3,2 мл физиологического раствора. Следовательно, в пробирке будет содержаться 3,2 мл физиологического раствора плюс 0,5 взвеси культуры, т.е. всего 3,7 мл. Выход микробных тел с 1 мл среды составит соответственно 3,7 млрд. м.к.

в) В жидких (полужидких) средах обогащения определение накопительного эффекта проводят по следующей методике:

    Разведение соответствующих тест-штаммов проводят по методике, описанной

                                                            -4    -5    -6

для определения чувствительности. Из разведений культур в 10  , 10  , 10  ,

  -7

10    до  1  мл  взвеси  из  каждого вносят в 3 - 5 пробирок с 10 мл жидкой

(полужидкой)   испытуемой  средой.   Параллельно   из   каждого  разведения

производят  высев  по  0,1  мл взвеси культуры на 3 - 5 чашек с питательным

агаром  для  определения  числа  жизнеспособных микробных клеток в посевной

дозе,  необходимого  для  последующего  вычисления  прироста  возбудителя в

средах обогащения.

После соответствующей инкубации посевов в среде обогащения (3 - 6 и более часов), независимо от видимых ее изменений, из каждой пробирки производят высев на чашки с питательным агаром (по 0,1 мл на чашку). В случае обильного роста культуры в жидкой среде ее перед посевом на чашки необходимо развести. Степень разведения учитывают при обсчете результатов.

Через 18 - 20 и более часов инкубации производят подсчет сформировавшихся колоний на чашках, засеянных из исходных взвесей культур и из жидких сред обогащения.

Прирост числа микроорганизмов при размножении в среде обогащения в процессе инкубации посевов в течение соответствующего времени (t) определяют по формуле (в %):

 

                                 n  - n

                                  t    o

                             J = ------- x 100,

                                    n

                                     t

 

    где:

    n  - число колоний на чашках, засеянных из жидких сред после инкубации;

     t

    n  - число колоний при высевах исходных взвесей культур.

     o

В процессе отработки методов контроля следует шире использовать методы статистической обработки данных при определении количественных величин для показателей (определение средних величин, средних квадратичных отклонений, вычисление коэффициента вариации, определение доверительных интервалов и статистической значимости разницы средних величин на контрольной и опытных средах).