Утверждаю

Заместитель Главного

государственного

санитарного врача СССР

А.И.ЗАИЧЕНКО

27 апреля 1984 г. N 3003-84

 

ВРЕМЕННЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ДЕЙСТВУЮЩЕГО ВЕЩЕСТВА ПРЕПАРАТА ПЛИКТРАН

И ЕГО МЕТАБОЛИТОВ (ОКИСИ ДИЦИКЛОГЕКСИЛОЛОВА,

ЦИКЛОГЕКСИЛОЛОВЯННОЙ КИСЛОТЫ) В БИОСУБСТРАТАХ

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

 

(Дополнение к Методическим указаниям N 2803-83)

 

1. Краткая характеристика препарата

 

Гидроокись трициклогексилолова, структурная формула:

 

            / \

           │   │

            \ /

      --     │

    /    \---Sn---OH

    \    /   │

      --    / \

           │   │

            \ /

 

    Эмпирическая формула: C  H  SnO.

                           11 34

Молекулярная масса: 385,156.

Синонимы и торговые названия: пликтран, цигексатин, тенкайд.

Химически чистое д.в. препарата пликтран - белое кристаллическое соединение с точкой плавления 245 °C. Точка плавления технического продукта (95 - 96% чистоты) - 196 - 198 °C.

Пликтран растворим в большинстве органических растворителей (хлороформ, гексан, метанол, этилацетат и др.). Растворимость в воде ограничена и составляет менее 1 мг/л.

Практически не летуч. Агрегативное состояние в рабочей зоне - гидрозоль.

Пликтран стабилен до 52 °C. Водная суспензия пликтрана стабильна в пределах pH от слабокислотной до щелочной.

Препаративная форма пликтрана стабильна в течение 2-х лет при хранении в нормальных условиях. При взаимодействии с сильными кислотами образуется соль.

Действующее вещество препарата пликтран - гидроокись трициклогексилолова в организме теплокровных образует два метаболита: окись дициклогексилолова и циклогексилоловянную кислоту.

    Препарат  пликтран  обладает  средней токсичностью, ЛД   для белых крыс

                                                          50

540  мг/кг  (орально). Острая оральная токсичность продуктов разложения для

белых  крыс:  окиси  дициклогексилолова  -  355 мг/кг, циклогексилоловянной

кислоты - 3600 мг/кг.

Препарат пликтран предлагается как высокоэффективный акарицид для наземного опрыскивания плодово-ягодных, цитрусовых, овощных, бахчевых культур и хлопчатника против растительных клещей, включая популяции, устойчивые к органофосфорным или другим акарицидам.

 

2. Методика определения д.в. препарата пликтран

и его метаболитов в биосубстратах хроматографическим методом

 

2.1. Основные положения

 

2.1.1. Принцип метода

Метод основан на извлечении пликтрана и его двух метаболитов из анализируемого биосубстрата органическими растворителями, хроматографировании смеси веществ в тонком слое пластинок "Силуфол" и проявлении хроматограмм спиртовым раствором гематоксилина (альтернативно - кверцетином или пирокатехоловым фиолетовым).

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода приведена в таблице.

 

┌──────┬──────┬───────┬────────┬───────┬──────┬──────────────┬────────┬────────┐

│Анали-│Анали-│Чувст- │Диапазон│Ср.    │Стан- │   Величина   │Относит.│Погреш- │

│зируе-│зируе-│витель-│опр-мых │процент│дарт- │   точного    │ станд. │ность   │

│мый   │мое   │ность  │кон-    │обнару-│ное   │  измерения   │отклон. │опреде- │

│объект│соеди-│методи-│центр., │жения  │откло-│эпсилон       │ Sr, %  │ления   │

│      │нение │ки,    │мкг/г,  │_      │нение │       альфа,K│        │дельта, │

│      │      │мкг/г, │мкг/мл  │C, %   │_     │              │        │%       │

│      │      │мкг/мл │        │       │S     │              │        │        │

├──────┼──────┼───────┼────────┼───────┼──────┼──────────────┼────────┼────────┤

│   1  │   2  │   3   │   4    │   5   │   6  │      7       │   8    │    9   │

├──────┼──────┼───────┼────────┼───────┼──────┼──────────────┼────────┼────────┤

│Печень│I     │0,2    │0,2 - 6 │95,1   │4,27  │+/- 5,31      │4,49    │+/- 5,6 │

│      │II    │0,2    │0,2 - 6 │95,1   │4,27  │+/- 5,31      │4,49    │+/- 5,6 │

│      │III   │0,2    │0,2 - 6 │95,1   │4,27  │+/- 5,31      │4,49    │+/- 5,6 │

├──────┼──────┼───────┼────────┼───────┼──────┼──────────────┼────────┼────────┤

│Почки │I     │0,2    │0,2 - 6 │95,1   │4,27  │+/- 5,31      │4,49    │+/- 5,6 │

│      │II    │0,2    │0,2 - 6 │95,1   │4,27  │+/- 5,31      │4,49    │+/- 5,6 │

│      │III   │0,2    │0,2 - 6 │95,1   │4,27  │+/- 5,31      │4,49    │+/- 5,6 │

├──────┼──────┼───────┼────────┼───────┼──────┼──────────────┼────────┼────────┤

│Легкие│I     │0,2    │0,2 - 6 │95,0   │5,10  │+/- 6,34      │5,36    │+/- 6,67│

│      │II    │0,2    │0,2 - 6 │95,0   │5,30  │+/- 6,59      │5,57    │+/- 6,94│

│      │III   │0,2    │0,2 - 6 │94,0   │5,90  │+/- 7,33      │6,27    │+/- 7,79│

├──────┼──────┼───────┼────────┼───────┼──────┼──────────────┼────────┼────────┤

│Мозг  │I     │0,2    │0,2 - 6 │90,0   │4,31  │+/- 5,36      │4,78    │+/- 5,95│

│      │II    │0,2    │0,2 - 6 │90,0   │4,72  │+/- 5,87      │5,24    │+/- 6,52│

│      │III   │0,2    │0,2 - 6 │91,0   │4,96  │+/- 6,17      │5,45    │+/- 6,78│

├──────┼──────┼───────┼────────┼───────┼──────┼──────────────┼────────┼────────┤

│Кровь │I     │0,2    │0,2 - 6 │95,1   │4,30  │+/- 5,35      │4,52    │+/- 5,62│

│      │II    │0,2    │0,2 - 6 │95,1   │4,27  │+/- 5,31      │4,49    │+/- 5,58│

│      │III   │0,1    │0,1 - 6 │94,0   │4,78  │+/- 5,94      │5,08    │+/- 6,32│

├──────┼──────┼───────┼────────┼───────┼──────┼──────────────┼────────┼────────┤

│Кал   │I     │0,2    │0,2 - 6 │87,0   │4,72  │+/- 5,87      │5,42    │+/- 6,75│

│      │II    │0,2    │0,2 - 6 │86,0   │4,70  │+/- 5,84      │5,46    │+/- 6,79│

│      │III   │0,1    │0,1 - 6 │90,1   │5,9   │+/- 7,33      │6,55    │+/- 8,13│

├──────┼──────┼───────┼────────┼───────┼──────┼──────────────┼────────┼────────┤

│Моча  │I     │0,1    │0,1 - 6 │97,4   │2,69  │+/- 3,34      │2,76    │+/- 3,43│

│      │II    │0,1    │0,1 - 6 │97,4   │3,05  │+/- 3,79      │3,13    │+/- 3,89│

│      │III   │0,1    │0,1 - 6 │97,4   │3,12  │+/- 3,88      │3,20    │+/- 3,98│

└──────┴──────┴───────┴────────┴───────┴──────┴──────────────┴────────┴────────┘

 

Примечание. I - трициклогексилоловогидроксид, II - дициклогексилоловооксид, III - циклогексилоловянная кислота.

 

2.1.3. Избирательность метода

Определению не мешают препараты акрекс, кельтан, антио, рагор, применяемые, как и пликтран, против растительноядных клещей.

 

2.2. Реактивы и материалы

 

н-Гексан хч, ТУ 6-09-3375-78.

Уксусная кислота хч, ГОСТ 61-75.

Этиловый спирт хч, ТУ 6-09-1710-77.

Лимонная кислота хч, ГОСТ 908-79, 0,5-процентный водный раствор.

Гематоксилин хч, имп., 0,1-процентный этанольный раствор.

Кверцетин хч (ЧССР), 0,1-процентный этанольный раствор.

Пирокатехоловый фиолетовый индикатор чда, ТУ 6-09-07-1087-78, насыщенный раствор в этиловом спирте.

Натрий сернокислый безводный чда, ГОСТ 4166-76.

Активированный уголь марки "БАУ", ТУ 6-09-3247-73.

Соляная кислота чда, ГОСТ 3118-77, водный раствор (1:9).

Силикагель КСК, ТУ 6-09-2525-72 (0,28 - 0,45 мм и 0,10 - 0,14 мм).

Крахмал, ГОСТ 10163-62.

Пластинки хроматографические "Силуфол" - UV254 (ЧССР).

Фильтры обеззоленные "синяя лента", ТУ 6-09-1678-77.

Пластинки стеклянные, 9 x 12 см.

Стандартные растворы гидроокиси трициклогексилолова, окиси дициклогексилолова, циклогексилоловянной кислоты с содержанием 100 мкг в 1 мл смеси гексан - уксусная кислота (20:3), готовят из хч веществ.

 

2.3. Приборы, аппаратура и посуда

 

Весы аналитические с погрешностью не более 0,001 г типа ВЛДП-100 г.

Весы технические с погрешностью не более 0,5 г, ГОСТ 19491-74.

Колбы конические, ГОСТ 10394-72, на 100, 250 мл.

Колбы круглодонные со шлифом, ГОСТ 10394-72, на 100 мл.

Ротационный испаритель, ТУ 25-11-917-74, тип ИР-1М.

Цилиндры мерные, ГОСТ 1770-74, на 25, 100, 250 мл.

Пипетки, ГОСТ 20292-74, на 0,1, 5, 25 мл.

Колбы мерные, ГОСТ 1770-74, на 25, 100 мл.

Стаканы химические, ГОСТ 10394-74.

Воронки лабораторные, ГОСТ 8613-75.

Камера для хроматографирования, ГОСТ 1065-66.

Камера для опрыскивания.

Пульверизаторы стеклянные, ГОСТ 19391-65.

Делительные воронки, ГОСТ 8613-75, на 100, 250 мл.

Осветитель ультрафиолетовый, ТУ 25-05-2098-76.

Хроматографические колонки стеклянные (2 x 20 см).

Анализатор световой вибрационный 236-Б-Гр.

Водяные бани, ТУ 46-22-587-75.

 

2.4. Подготовка к определению

 

2.4.1. Приготовление растворов

Стандартные растворы гидроокиси трициклогексилолова, окиси дициклогексилолова и циклогексилоловянной кислоты (100 мкг/мл). I. 25 мг хч вещества помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в смеси гексан - уксусная кислота (20:3) и доводят до метки. II. Из I раствора 10 мл отбирают в мерную колбу емкостью 25 мл и доводят смесью гексан - уксусная кислота до метки. Стандартные растворы хранят до 30 дней.

0,1-процентный раствор гематоксилина в 96% этаноле. 0,1 г гематоксилина помещают в 100 мл колбу и добавляют 96% этанол до метки. На каждые 100 мл раствора добавляют 1 - 2 капли конц. соляной кислоты. Реактив хранят в темной склянке до 60 дней.

0,1-процентный раствор кверцетина в 96% этаноле. 0,5 г кверцетина растворяют в 300 мл этилового спирта при слабом нагревании, охлаждают и доводят объем до 500 мл этиловым спиртом. Реактив хранят в темной склянке не более 1 недели.

0,5-процентный раствор лимонной кислоты. 0,5 г лимонной кислоты растворяют в 99,5 мл дистиллированной воды. Реактив хранят не более 1 месяца.

2.4.2. Приготовление хроматографической колонки с силикагелем

В стеклянную колонку размером 2 x 20 см, снабженную краном и пористым стеклянным фильтром, заливают на 1/2 высоты смесь гексан - уксусная кислота (20:3) и помещают 7 г силикагеля КСК (0,28 - 0,45 мм). Колонку перед употреблением промывают смесью гексан - уксусная кислота (20:3).

2.4.3. Приготовление хроматографических пластинок с тонким слоем сорбента

Из 40 г силикагеля КСК (0,10 - 0,14 мм), 1,5 г крахмала в 110 мл воды готовят сорбционную массу. Заваривают крахмал 15 мл воды, доливают остальную воду, засыпают силикагель и хорошо перемешивают. 10 г сорбционной массы наливают на пластинку и, покачивая, равномерно распределяют по поверхности. Сушат в течение ночи при комнатной температуре. Хранят в эксикаторе.

 

2.5. Проведение определения

 

2.5.1. Экстракция и очистка

Кровь. 5 мл крови экстрагируют трижды по 5 мл смесью гексан - уксусная кислота (20:3). Объединенные экстракты проводят через воронку с сульфатом натрия, удаляют растворитель на ротационном испарителе при температуре бани не выше 50 °C, растворяют сухой остаток в минимальном количестве смеси гексан - уксусная кислота (20:3) и количественно наносят на хроматографическую пластинку.

Моча. 25 мл мочи экстрагируют дважды по 25 мл смесью гексан - уксусная кислота (20:3), затем к моче добавляют 5 мл этанола и опять экстрагируют 5 мл смеси гексан - уксусная кислота (20:3). Последнюю экстракцию повторяют еще раз, предварительно добавив 5 мл этанола. Объединенные экстракты проводят через воронку с сульфатом натрия и далее поступают, как и при анализе крови.

Кал. 5 г кала экстрагируют трижды по 5 мл смесью гексан - уксусная кислота (20:3). К объединенным экстрактам добавляют 0,5 г активированного угля, перемешивают раствор в течение 5 минут, отфильтровывают от частичек угля и проводят через колонку с силикагелем в колбу для выпаривания, туда же собирают и смывы (гексан - уксусная кислота 20:3) угля и колбы (2 x 10 мл), пропущенные через колонку. Удаляют растворитель на ротационном испарителе и далее поступают, как при анализе крови.

Печень, почки, мозг, легкие. 5 г пробы тщательно измельчают, помещают в коническую колбу на 100 мл, добавляют 15 мл смеси гексан - уксусная кислота (20:3) и экстрагируют в течение 10 минут. Экстракцию повторяют еще дважды по 10 мл смеси. Собирают все экстракты в отдельную колбу, а к биоматериалу добавляют 5 мл разбавленной соляной кислоты (1:9), помешивают смесь 2 - 3 минуты и декантируют в колбу с первоначальными экстрактами. Процедуру повторяют еще раз. Объединенные экстракты проводят через колонку с силикагелем в колбу для выпаривания. Туда же собирают смывы колбы (2 x 10 мл), пропущенные через колонку. Выпаривают на ротационном испарителе растворители и далее поступают, как при анализе крови.

2.5.2. Хроматографирование и проявление

Удалив растворитель, сухой остаток растворяют в минимальном количестве смеси гексан - уксусная кислота (20:3) и количественно наносят на хроматографическую пластинку, через 5 минут развивают хроматограмму в системе подвижных растворителей гексан:уксусная кислота (49:10,5). После окончания хроматографирования пластинку вынимают из камеры и оставляют на несколько минут на воздухе (под вытяжкой) для удаления следов растворителей. Хроматограммы проявляют одним из нижеследующих способов.

1. Опрыскивание 0,1% раствором гематоксилина в 95% этиловом спирте, УФ-облучение в течение 5 минут и опрыскивание 0,5-процентным водным раствором лимонной кислоты.

2. УФ-облучение в течение 10 минут и опрыскивание насыщенным этанольным раствором пирокатехолового фиолетового.

3. Опрыскивание 0,2 н раствором серной кислоты, УФ-облучение в течение 10 минут и опрыскивание 0,1-процентным этанольным раствором кверцетина.

    При  наличии  гидроокиси трициклогексилолова, окиси дициклогексилолова,

циклогексилоловянной   кислоты  в  пробе   на  хроматограмме,  обработанной

гематоксилином, появляются сиреневые пятна на розовом фоне; пирокатехоловым

фиолетовым  -  синие  пятна  на светлом фоне, с R  соответственно: 0,76 +/-

                                                 f

0,01, 0,26 +/- 0,01, 0,14 +/- 0,01.

Содержание гидроокиси трициклогексилолова, окиси дициклогексилолова, циклогексилоловянной кислоты в пробе находят путем сравнения размеров и интенсивности окраски пятен с пятнами стандартных растворов.

 

2.6. Обработка результатов анализа

 

Количество гидроокиси трициклогексилолова, окиси дициклогексилолова и циклогексилоловянной кислоты рассчитывают по формулам:

в крови и моче:

 

                                      A

                                  X = -,

                                      V

 

где:

X - концентрация веществ в мкг/мл;

A - количество вещества, обнаруженное на хроматограмме, мкг;

V - объем взятой для анализа крови или мочи, мл;

в печени, почках, мозге, легких, кале:

 

                                      A

                                  X = -,

                                      P

 

где:

X - концентрация вещества, мкг/г;

A - количество вещества, обнаруженное на хроматограмме, мкг;

P - навеска биосубстрата, г.

 

3. Требования безопасности

 

При работе с пликтраном и его метаболитами беречь глаза, руки, а также соблюдать все требования безопасности, необходимые при работе с кислотами, ядовитыми и взрывоопасными веществами.