Утверждены

Минздравом СССР

31 июля 1984 г. N 3066-84

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ КОТОФОРА В ВОДЕ, ПОЧВЕ, СЕМЕНАХ

ХЛОПЧАТНИКА, ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

И БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

И УФ-СПЕКТРОСКОПИИ

 

    Краткая характеристика препарата. Котофор - 2-этилтио-4,6-бис-

(изопропиламино)-симм-триазин.      Брутто-формула      C  H  N S.

                                                         11 21 5

Молекулярная  масса  255,39.  Химически  чистый  препарат  - белый

порошок  с  т.  пл.  104  - 106 °C. Трудно растворяется в воде (16

мг/л), хорошо - в органических растворителях (хлороформе, ацетоне,

метаноле).  Малотоксичен для теплокровных животных. МДУ котофора в

хлопковом  масле  4,5; жмыхе - 0,38 мг/кг. ПДК котофора в воде 1,0

мг/л.

Котофор рекомендован для применения в качестве селективного гербицида для довсходового опрыскивания на посевах овощных, бахчевых культур и хлопчатника.

Принцип метода. Метод основан на извлечении котофора из исследуемой пробы органическим растворителем, очистке экстракта и последующем определении методами тонкослойной хроматографии и УФ-спектрофотометрии.

Метрологическая характеристика метода дана в таблице 148.

 

Таблица 148

 

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА

 

┌─────────────┬─────┬────────────────────────────────────────────────────────┐

│  Параметры  │Метод│                 Анализируемый объект                   │

│             │ана- ├──────────┬──────────┬───────────┬────────────┬─────────┤

│             │лиза │   вода   │  почва   │  семена   │растительные│био-     │

│             │     │          │          │хлопчатника│  продукты  │материал │

├─────────────┼─────┼──────────┼──────────┼───────────┼────────────┼─────────┤

│Диапазон     │ТСХ  │0,02 - 1,0│0,05 - 1,0│-          │-           │0,6 - 1,0│

│определяемых │УФ   │0,02 - 0,5│0,05 - 0,5│0,05 - 0,5 │0,05 - 0,5  │-        │

│концентраций,│     │          │          │           │            │         │

│мг/кг или    │     │          │          │           │            │         │

│мг/л         │     │          │          │           │            │         │

│Предел       │ТСХ  │1         │5         │-          │-           │0,6      │

│обнаружения, │УФ   │2         │5         │2,5        │2,5         │-        │

│мкг          │     │          │          │           │            │         │

│Предел       │ТСХ  │0,02      │0,05      │-          │-           │0,6      │

│определения, │УФ   │0,02      │0,05      │0,05       │0,05        │-        │

│мг/кг или    │     │          │          │           │            │         │

│мг/л         │     │          │          │           │            │         │

│Среднее      │ТСХ  │96,8      │87,0      │-          │-           │75,0     │

│значение     │УФ   │97,0      │94,0      │84,0       │90,0        │-        │

│определения  │     │          │          │           │            │         │

│стандартных  │     │          │          │           │            │         │

│           _ │     │          │          │           │            │         │

│количеств (с)│     │          │          │           │            │         │

│при n = 5, % │     │          │          │           │            │         │

│Стандартное  │ТСХ  │+/- 5,4   │+/- 3,47  │-          │-           │+/- 5,93 │

│отклонение S,│УФ   │+/- 2,66  │+/- 2,95  │+/- 10,7   │+/- 3,95    │-        │

│%            │     │          │          │           │            │         │

│Доверительный│ТСХ  │+/- 4,9   │+/- 3,1   │-          │-           │+/- 5,3  │

│интервал     │УФ   │+/- 2,63  │+/- 4,69  │+/- 17,01  │+/- 6,28    │-        │

│среднего при │     │          │          │           │            │         │

│p = 0,95;    │     │          │          │           │            │         │

│n = 5, %     │     │          │          │           │            │         │

└─────────────┴─────┴──────────┴──────────┴───────────┴────────────┴─────────┘

 

Избирательность метода. Определению остаточных количеств котофора в воде, почве, семенах хлопчатника, растительных продуктах и биологическом материале не мешают близкие по строению и области применения пестициды - мезоранил, прометрин.

Реактивы и материалы. Этиловый спирт х.ч. Ацетон ч.д.а. н-Гексан х.ч. Хлороформ ч.д.а. Этиловый эфир (медицинский). Углерод четыреххлористый х.ч. Сульфат натрия безводный х.ч. Силикагель КСК. Сульфат кальция ч.д.а. Оксид алюминия для хроматографии. Индикатор бромфеноловый синий ч.д.а., 0,4-процентный раствор в ацетоне. Индикатор бромтимоловый синий ч.д.а. Нитрат серебра х.ч., 2-процентный в.р. Лимонная кислота х.ч., 4-процентный в.р. Хлороводородная кислота х.ч., 1 н водный раствор. Гидроксид натрия х.ч., 1 н в.р. Уголь активированный марки БАУ. Фильтры бумажные. Пластинки для хроматографии "Силуфол". Вата обезжиренная (гигроскопическая). Стандартные растворы котофора в хлороформе с содержанием 100, 500 мкг/мл.

Приборы, аппаратура, посуда. Спектрофотометр. Шкаф вытяжной химический. Шкаф сушильный. Ротационный вакуумный испаритель. Аппарат для встряхивания жидкости в лабораторной посуде. Баня водяная. Камера для опрыскивания. Камера для хроматографирования. Пульверизатор стеклянный. Воронки: делительные на 150, 250, 1000 мл; простые конусообразные с коротким стеблем N 5. Колбы: конические на 250 мл; круглодонные на 100 мл; мерные с коническим шлифом на 100, 1000 мл. Капилляры стеклянные. Пипетки на 0,1; 10 мл. Пластинки хроматографические стеклянные размером 9 x 12 см. Сито лабораторное N 5 и 40.

Подготовка к определению. Приготовление растворов. Приготовление 1 н раствора хлороводородной кислоты: 86 мл 36-процентной хлороводородной кислоты доводят в мерной колбе до 1 л дистиллированной водой. Раствор можно приготовить на фиксанале. Хранить в прохладном месте в плотно закрытой склянке. Срок хранения 3 мес.

Приготовление 1 н раствора едкого натра: 40 г едкого натра растворяют в минимальном количестве дистиллированной воды и доводят ею до 1 л. Рекомендуется использовать свежеприготовленные растворы.

Проявляющие реагенты: N 1 - смесь равных объемов 0,4-процентного раствора бромфенолового синего в ацетоне и 2-процентного водного раствора азотнокислого серебра. Готовят перед употреблением; N 2 - 4-процентный водный раствор лимонной кислоты. Хранить в прохладном месте не более 10 дней; N 3 - в мерную колбу на 250 мл помещают 1,0 г нитрата серебра, 0,1 г бромтимолового синего, растворяют в 90 мл дистиллированной воды и доводят объем до метки ацетоном. Готовят перед употреблением.

Стандартные растворы. Стандартные растворы котофора с содержанием 100 и 500 мкг действующего начала препарата в 1 мл хлороформа готовят из химически чистого или технического препарата с учетом процентного содержания действующего вещества. Растворы хранить в прохладном месте не более 1 мес.

Приготовление пластинок с тонким слоем КСК. Тщательно промытую и высушенную пластинку размером 9 x 12 см протирают ватным тампоном, смоченным в этиловом спирте или диэтиловом эфире, и покрывают сорбционной массой, приготовленной из 35 г силикагеля КСК, 2 г сульфата кальция и 90 мл дистиллированной воды. Сорбционную массу готовят, тщательно растирая в фарфоровой ступке сначала сухую смесь силикагеля с гипсом, а затем и с водой до однородной массы. Затем 10 г сорбционной массы равномерно распределяют по всей поверхности пластинки, покачивая ее. Пластинки сушат при комнатной температуре 18 - 20 ч. Хранят в эксикаторе.

Силикагель предварительно очищают от примесей, для чего заливают его на 18 - 20 ч хлороводородной кислотой (1:1). Потом кислоту сливают, промывают водой и кипятят 2 - 3 ч с разбавленной азотной кислотой (1:1), промывают обычной водой, а затем и дистиллированной до нейтральной реакции промывных вод, сушат в сушильном шкафу 4 - 6 ч при температуре 130 °C. Обработанный и просушенный силикагель дробят и просеивают через сито N 40. Хранят в склянке с притертой пробкой.

Приготовление пластинок с тонким слоем окиси алюминия. Для приготовления сорбционной массы на 10 пластинок берут 50 г оксида алюминия, просеянного через сито N 40, 5 г сульфата кальция. Оксид алюминия с сульфатом кальция тщательно растирают в фарфоровой ступке, переносят в коническую колбу, прибавляют 150 мл дистиллированной воды и встряхивают до образования однородной массы. Полученную массу наносят тонким слоем на заранее приготовленные стеклянные пластинки. Пластинки сушат в течение 12 - 15 ч при комнатной температуре. Готовые пластинки хранят в эксикаторе.

    Построение градуировочного графика для спектрофотометрического

определения.  На  пластинку наносят 0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,5

мл  стандартного раствора с концентрацией котофора 100 мкг/мл, что

соответствует  2,  5, 10, 20, 30, 50, 70 мкг, и хроматографируют в

смеси  хлороформ  -  гексан (4:1). С целью спектрофотометрирования

пластинка,  снятая с камеры, проявляется не полностью, а частично.

При этом участок опытной площади покрывается листком чистой бумаги

и опрыскивается проявляющим реактивом N 3 только область одного из

пятен  (лучше  одна  из  концевых  областей,  например  с  70  мкг

вещества).  Затем  предполагаемые  площади опытных пятен на уровне

стандарта  количественно  вместе  с  оксидом  алюминия переносят в

центрифужные   пробирки.  В  каждую  пробирку  заливают  по  3  мл

хлороформа,  закрывают  корковой пробкой и оставляют на 2 ч. Время

от  времени  смесь  взбалтывают, затем экстракт центрифугируют при

                             -1

частоте  вращения  1500  мин.    в  течение  15  мин.  После этого

хлороформный  слой  центрифугата  осторожно,  не взмучивая осадок,

выливают   в   другую   центрифужную   пробирку  и  объем  доводят

хлороформом  до  3 мл. Затем раствор переливают в кювету на 3 мм и

спектрофотометрируют   при  длине  волны  247  нм.  Строят  график

зависимости   оптической   плотности   от  концентрации  вещества.

Линейность  показаний  наблюдается   в  пределах  2  - 50 мкг. При

содержании  котофора в пробе более 50 мкг необходимо развести ее и

коэффициент разведения учитывать при расчетах.

Отбор проб. Пробы воды, почвы, семян хлопчатника, продуктов питания растительного происхождения и биологического материала нужно транспортировать и хранить в стеклянной или полиэтиленовой таре, причем пробы биоматериала следует хранить при температуре минус 5 - минус 8 °C.

Ход анализа. Экстракция методом ТСХ. Пробу воды (1 л) помещают в делительную воронку и трижды экстрагируют хлороформом порциями по 50, 30, 30 мл. Объединенный экстракт сливают через воронку с 5 - 7 г безводного сульфата натрия в колбу ротационного испарителя и отгоняют хлороформ до объема 0,1 - 0,2 мл при температуре бани 80 °C.

Навеску воздушно-сухой почвы (100 г) растирают в ступке, просеивают через сито N 5, заливают в конической колбе ацетоном до покрытия пробы и оставляют на ночь. Отфильтрованный объединенный экстракт кипятят на водяной бане при температуре бани 80 °C с активированным углем марки БАУ (5 - 7 г) до исчезновения окраски. Растворитель фильтруют через бумажный фильтр "синяя лента" и безводный сульфат натрия в колбу для отгонки растворителя. Уголь на фильтрате промывают несколькими порциями ацетона. Ацетон отгоняют с помощью ротационного испарителя до объема 0,1 - 0,2 мл.

Пробу биологического материала (кровь, печень, почки, легкие, селезенка, сердце, мышечная ткань) 5 г тщательно измельчают ножницами, помещают в колбу с притертой пробкой, заливают 30 мл смеси гексан - ацетон (1:1) и периодически встряхивают в течение часа. Смесь гексан - ацетон сливают, пробу повторно заливают смесью и опять периодически встряхивают 1 ч. Экстракцию повторяют трижды. Объединенные экстракты сушат безводным сульфатом натрия (3 - 5 г) и упаривают при температуре бани 80 °C. К сухому остатку прибавляют 2 мл 1 н хлороводородной кислоты, тщательно ополаскивают стенки колбы. Смывы сливают в делительную воронку, фильтруя через небольшой слой ваты. Колбу трижды ополаскивают 1 мл 1 н соляной кислоты, смывы сливают в ту же делительную воронку. В делительную воронку добавляют 4 мл 1 н раствора едкого натра и перемешивают, а затем по каплям приливают 1 н раствор едкого натра до нейтральной реакции (по индикаторной бумажке). После этого в воронку приливают 10 мл предварительно насыщенного водой хлороформа и встряхивают 1 - 2 мин. Хлороформный экстракт сливают из воронки в колбу через слой безводного сульфата натрия. Экстракцию хлороформом повторяют трижды. Объединенный хлороформный экстракт отгоняют на ротационном испарителе при температуре бани 80 °C до объема 0,1 - 0,2 мл.

Хроматографирование. Подготовленные экстракты количественно наносят при помощи капиллярной пипетки на хроматографическую пластинку "Силуфол" так, чтобы диаметр пятна не превышал 1 см. Центр пятна должен быть на расстоянии 1,5 см от нижнего края пластинки. Колбочку с экстрактом 2 - 3 раза смывают небольшими порциями хлороформа, который также наносят в центр первого пятна. Справа и слева от пробы на расстоянии 2 см от нее наносят стандартные растворы (шприцем или микропипеткой), содержащие 5, 10 или 20 мкг препарата.

    Пластинку     с     нанесенными    растворами    помещают    в

хроматографическую  камеру,  в которую предварительно налита смесь

растворителей  гексан - ацетон (10:3) или четыреххлористый углерод

-  диэтиловый эфир (4:1). Край пластинки не должен быть погружен в

раствор  более  чем  на  0,5  см.  После того как фронт подвижного

растворителя  поднимется  на 10 см, пластинку вынимают и оставляют

на   несколько   минут   на   воздухе   для  испарения  подвижного

растворителя.  Пластинку  обрабатывают  с  помощью  пульверизатора

проявляющим  реактивом N 1. После высушивания пластинки на воздухе

ее  обрабатывают  проявляющим  реактивом  N  2.  Зоны  локализации

препарата  обнаруживаются  в  виде  синих  пятен  на желтом фоне с

различными величинами R  (табл. 149).

                       f

 

Таблица 149

 

                       ВЕЛИЧИНЫ R  КОТОФОРА

                                 F

 

┌────────────────────────────────────┬──────────────────┬─────────────────┐

│  Система подвижных растворителей   │  Силикагель КСК  │    "Силуфол"    │

├────────────────────────────────────┼──────────────────┼─────────────────┤

│Гексан - ацетон (10:3)              │0,52 +/- 0,01     │0,50 +/- 0,01    │

│Четыреххлористый углерод -          │0,21 +/- 0,01     │0,29 +/- 0,01    │

│диэтиловый эфир (4:1)               │                  │                 │

└────────────────────────────────────┴──────────────────┴─────────────────┘

 

Количество котофора определяют путем сравнения размеров и интенсивности окраски пятен пестицида на хроматограммах пробы и стандартного раствора.

Экстракция методом УФ-спектрофотометрии. Экстракцию проводят аналогично методу, описанному выше. Размельченные в ступке семена хлопчатника (50 г) трехкратно экстрагируют хлороформом порциями по 50 мл. Хлороформные экстракты объединяют, фильтруют через бумажный фильтр в выпарительную колбочку и выпаривают до полного удаления хлороформа. Содержимое выпарительной колбочки переносят в коническую колбу на 250 мл путем двукратного смыва по 25 мл ацетоном. Затем в эту же колбу добавляют 100 мл ледяной дистиллированной воды. Колбу ставят в морозильную камеру холодильника на 1 ч, затем вынимают и содержимое быстро фильтруют через бумажный фильтр в другую коническую колбу и вновь ставят в морозильную камеру. Через 1 ч колбу снимают, содержимое фильтруют в выпарительную колбочку и имеющийся в фильтрате ацетон выпаривают на ротационном испарителе или водяной бане. Оставшуюся водную фракцию экстракта переносят в делительную воронку и трижды экстрагируют хлороформом порциями по 25 мл. Экстракты объединяют, сушат над безводным сульфатом натрия и выпаривают досуха.

Из средней пробы растительных продуктов (картофель, лук, томаты), размельченных миксером или мясорубкой, отбирают навеску 50 г. Экстракцию проводят трехкратно хлороформом по 100 мл в течение 30 - 40 мин. Полученные экстракты объединяют и выпаривают досуха на ротационном испарителе или водяной бане.

    Хроматографирование   и   спектрофотометрическое  определение.

Колбочку  из-под  экстракта  трехкратно  ополаскивают  по  0,1  мл

хлороформа   и   полученный  смыв  наносят  на  хроматографическую

пластинку,  отступая на 1 см от ее нижнего края. Рядом с пробой на

пластинку  наносят  стандарт  с  известной концентрацией котофора.

Затем  развивают  хроматограмму  в смеси хлороформ - гексан (4:1).

После  завершения  разгонки (10 см) пластинку вынимают из камеры и

высушивают  при  комнатной  температуре  в  течение 10 мин. Покрыв

листком   чистой   бумаги   участок   опытной  площади  пластинки,

обрабатывают  проявляющим  реактивом  N  3  лишь  зону локализации

свидетеля  (R   0,50  -  0,60). Далее поступают, как описано выше,

             f

спектрофотометрируя  конечные  растворы  при  длине  волны 247 нм.

Количество котофора определяют по градуировочному графику.

    Обработка   результатов   анализа.   Содержание   котофора   в

анализируемой  пробе  (X,  мг/л,  мг/кг или мгк/г) рассчитывают по

формуле:

 

                                  A

                              X = -,

                                  P

 

где:

A - количество котофора, найденное путем сравнения со стандартом (метод ТСХ) или по градуировочному графику (спектрофотометрическое определение), мкг;

P - количество или объем пробы, взятой для анализа, мл или г.

Требования безопасности. При определении остаточных количеств котофора необходимо соблюдать правила техники безопасности при работе с ядовитыми, взрыво- и огнеопасными веществами.