Утверждены

Минздравом СССР

8 июня 1987 г. N 4339-87

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ГЕТЕРОФОСА, ЭТАФОСА И ИХ МЕТАБОЛИТОВ

В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ, МОЛОКЕ, ЯЙЦАХ МЕТОДОМ

ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

 

Краткая характеристика препаратов. Характеристики гетерофоса, этафоса приведены в Унифицированной методике.

Характеристика метаболитов этафоса и гетерофоса приведена в таблице 28.

 

Таблица 28

 

ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТАБОЛИТОВ ГЕТЕРОФОСА И ЭТАФОСА

 

┌───────────────────────┬─────────────────────┬──────────────┬────────────┐

│  Химическое название  │ Структурная формула │Брутто-формула│Молекулярная│

│                       │                     │              │   масса    │

├───────────────────────┼─────────────────────┼──────────────┼────────────┤

│O-Этил-O-фенилфосфат   │C H O  O             │C H  O P      │202         │

│                       │ 2 5 \ ││            │ 8 11 4       │            │

│                       │       P -OH         │              │            │

│                       │     /               │              │            │

│                       │C H O                │              │            │

│                       │ 6 5                 │              │            │

│                       │                     │              │            │

│O-Этил-S-пропилфосфат  │C H O  O             │C H  O PS     │184         │

│                       │ 2 5 \ ││            │ 5 13 3       │            │

│                       │       P -SC H       │              │            │

│                       │     /      3 7      │              │            │

│                       │   HO                │              │            │

│                       │                     │              │            │

│O-Этил-O-фенил-S-      │C H O  O             │C H  O PS     │232         │

│метилтиофосфат         │ 2 5 \ ││            │ 9 13 3       │            │

│                       │       P -SCH        │              │            │

│                       │     /       3       │              │            │

│                       │C H O                │              │            │

│                       │ 6 5                 │              │            │

│                       │                     │              │            │

│O-Этил-O-фенилтиофосфат│C H O  O             │C H  O PS     │218         │

│                       │ 2 5 \ ││            │ 8 11 3       │            │

│                       │       P -SH         │              │            │

│                       │     /               │              │            │

│                       │C H O                │              │            │

│                       │ 6 5                 │              │            │

│                       │                     │              │            │

│O-Этил-0,2,4-дихлор-   │      C H O  O       │C H O Cl PS   │251,5       │

│фенилтиофосфат         │       2 5 \ ││      │ 8 9 3  2     │            │

│                       │             P -SH   │              │            │

│                       │           /         │              │            │

│                       │2,4Cl C H O          │              │            │

│                       │     2 6 3           │              │            │

│                       │                     │              │            │

│O-Метил-O-фенил-S-     │ CH O  O             │C  H  O PS    │246         │

│пропилтиофосфат        │   3 \ ││            │ 10 15 3      │            │

│                       │       P -SC H       │              │            │

│                       │     /      3 7      │              │            │

│                       │C H O                │              │            │

│                       │ 6 5                 │              │            │

│                       │                     │              │            │

│O-Этил-O-метил-S-      │C H O  O             │C H  O PS     │198         │

│пропилтиофосфат        │ 2 5 \ ││            │ 6 15 3       │            │

│                       │       P -SC H       │              │            │

│                       │     /      3 7      │              │            │

│                       │ CH O                │              │            │

│                       │   3                 │              │            │

│                       │                     │              │            │

│O,O-Диметил-S-пропил-  │       O             │C H  O PS     │184         │

│тиофосфат              │       ││            │ 5 13 3       │            │

│                       │(CH O) P -SC H       │              │            │

│                       │   3  2     3 7      │              │            │

│                       │                     │              │            │

│O-Этил-O-метилтиофосфат│C H O  O             │C H O PS      │156         │

│                       │ 2 5 \ ││            │ 3 9 3        │            │

│                       │       P -SH         │              │            │

│                       │     /               │              │            │

│                       │ CH O                │              │            │

│                       │   3                 │              │            │

│                       │                     │              │            │

│O,O-Диметилтиофосфат   │       O             │C H O PS      │142         │

│                       │       ││            │ 2 7 3        │            │

│                       │(CH O) P -SH         │              │            │

│                       │   3  2              │              │            │

└───────────────────────┴─────────────────────┴──────────────┴────────────┘

 

Принцип метода. Методика основана на определении S-пропильных ФОП (гетерофоса, этафоса и десяти их метаболитов) методом ГЖХ. Указанные соединения извлекают из субстратов смесью ацетона и 0,1 н HCl (9:1), гетерофос из молока и яиц извлекают смесью ацетона с этанолом (3:1). Экстракты очищают перераспределением в системе жидкость - жидкость.

Определение методом ГЖХ проводят на хроматографе, снабженном ТИД и ДПР. Используют неподвижные фазы SE-30 на хроматоне N-AW-HMDS и 3% OV-101 на инертоне-супер. Для разделения пестицидов и их метаболитов определение проводят в изотермическом режиме при двух температурах - 190 и 127 °C.

Метрологическая характеристика метода приведена в таблице 29.

 

Таблица 29

 

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕТЕРОФОСА, ЭТАФОСА И ИХ МЕТАБОЛИТОВ

 

┌────────────────────┬─────────┬─────────────────┬────────┬───────┬────────────┐

│      Вещество      │Исследуе-│  Нижний предел  │Среднее │Относи-│Доверитель- │

│                    │мый      │  обнаружения,   │значение│тельное│ный интервал│

│                    │объект   │      мг/кг      │опреде- │стан-  │среднего при│

│                    │         │                 │ления, %│дартное│p = 0,95,   │

│                    │         │                 │        │откло- │n = 5, +/- %│

│                    │         │                 │        │нение  │            │

├────────────────────┼─────────┼─────────────────┼────────┼───────┼────────────┤

│Гетерофос           │Молоко   │0,002            │70      │6,7    │8,3         │

│-"-                 │Яйца     │0,002            │65      │6,3    │7,8         │

│-"-                 │Биологи- │0,001 - 0,01 <**>│79      │8,3    │10,3        │

│                    │ческие   │                 │        │       │            │

│                    │субстраты│                 │        │       │            │

│                    │<*>      │                 │        │       │            │

│Этафос              │То же    │0,005 - 0,05     │83      │12,2   │15,1        │

│Метаболиты          │         │                 │        │       │            │

│O-Этил-O-фенилфосфат│-"-      │0,001 - 0,01     │74      │13,5   │16,8        │

│O-Этил-S-пропил-    │-"-      │0,005 - 0,05     │79      │13,6   │16,9        │

│тиофосфат           │         │                 │        │       │            │

│O-Этил-O-фенил-S-   │-"-      │0,005 - 0,05     │81      │8,1    │10,1        │

│метилтиофосфат      │         │                 │        │       │            │

│O-Этил-O-фенилтио-  │-"-      │0,05 - 0,5       │70      │3,8    │4,7         │

│фосфат              │         │                 │        │       │            │

│O-Этил-0-2,4-ди-    │-"-      │0,01 - 0,1       │74      │11,1   │13,7        │

│хлорфенилтиофосфат  │         │                 │        │       │            │

│O-Метил-O-фенил-S-  │-"-      │0,01 - 0,1       │78      │4,3    │5,3         │

│пропилтиофосфат     │         │                 │        │       │            │

│O-Этил-O-метил-S-   │-"-      │0,01 - 0,1       │84      │10     │12,4        │

│пропилтиофосфат     │         │                 │        │       │            │

│O,O-Диметил-S-      │-"-      │0,005 - 0,05     │80      │5,5    │6,8         │

│пропилтиофосфат     │         │                 │        │       │            │

│O-Этил-O-метилтио-  │-"-      │0,05 - 0,5       │81      │10,9   │13,5        │

│фосфат              │         │                 │        │       │            │

│O,O-Диметилтиофосфат│-"-      │0,05 - 0,5       │78      │13,8   │17,1        │

└────────────────────┴─────────┴─────────────────┴────────┴───────┴────────────┘

 

--------------------------------

<*> Расчет проведен суммарно для различных органов (печень, почки, мозг и др.).

<**> Приведены нижние пределы обнаружения в исследуемых объектах в зависимости от взятой навески (2 - 20 г).

 

Избирательность метода. Определению могут мешать ФОП, имеющие близкие времена удерживания.

Реактивы и растворы. Ацетон ч. Хлороводородная кислота ч., 0,1 н водный раствор. н-Гексан ч., х.ч. Спирт этиловый, ректиф. Сульфат натрия безводный свежеприготовленный. Вода дистиллированная.

    Неподвижная  фаза  -  5%  SE-30 на хроматоне N-AW-HMDS (0,16 -

0,20  мм),  3%  OV-101  на  инертоне-супер  (0,16 - 0,20 мм). Азот

особой  чистоты,  содержание O  не более 0,003%. Водород. Основные

                              2

стандартные  растворы  гетерофоса,  этафоса  и  их  метаболитов  в

н-гексане  по  1000  мкг/мл.  Хранят в холодильнике 6 мес. Рабочие

стандартные растворы гетерофоса, этафоса и метаболитов в н-гексане

по 10 мкг/мл. Хранят в холодильнике в течение двух недель. Готовят

серию стандартных растворов.

Приборы и посуда. Газовый хроматограф с ТИД и ДЭЗ марки "Цвет", "Газохром" и др. Микроизмельчитель тканей РТ-2 или мясорубка. Прибор для отгонки растворителей (ротационный вакуумный испаритель) типа ИР-1М. Микрошприцы на 10 мкл (МШ-10). Колбы: конические со шлифом и пробками вместимостью 100, 250 и 500 мл; круглодонные со шлифом для отгонки растворителей; мерные вместимостью 50 и 100 мл. Делительные воронки на 50, 100 и 250 мл. Воронки химические. Пробирки мерные со шлифом вместимостью 5 и 10 мл. Пипетки на 1, 5 и 10 мл. Микропипетки на 0,1 мл.

Подготовка к определению. Для проведения клинических исследований на содержание гетерофоса и этафоса отбирают 100 мл суточной мочи, 2 мл крови.

Подготовка хроматографической колонки для ГЖХ. Колонку заполняют общепринятым в хроматографии способом, кондиционируют 48 ч при температуре на 20 °C выше рабочей температуры колонки.

Ход анализа. Экстракция и очистка экстракта. Исследуемые органы и ткани (печень, почки, селезенка, легкие, головной мозг, мясо) измельчают в микроизмельчителе тканей или мясорубке. Отбирают 2 - 20 г средней пробы (для пищевых продуктов навеска 20 г), заливают в зависимости от взятой навески 15 - 250 мл смеси ацетона с 0,1 н хлороводородной кислотой (9:1) и оставляют на 1 ч, периодически перемешивая пробу стеклянной палочкой и встряхивая. Затем растворитель сливают в делительную воронку, фильтруя через вату. Заливают пробу новой порцией смеси и экстрагируют еще 30 мин. Экстракты объединяют. Пробу промывают смесью дважды порциями по 5 - 10 мл и смывы присоединяют к экстракту. В делительную воронку приливают 50 мл дистиллированной воды, перемешивают и добавляют 50 мл н-гексана. Осторожно встряхивают в течение 5 мин. Отделяют верхний н-гексановый слой, сливая его через безводный сульфат натрия (7 - 10 г), насыпанный на фильтр, вложенный в воронку. Из нижнего водного слоя экстрагируют ФОП н-гексаном еще два раза порциями по 40 мл, объединяя экстракты с первым. Упаривают экстракт на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани 40 - 45 °C примерно до 1 мл. Переносят остаток в мерную пробирку со шлифом, ополаскивая колбу небольшими порциями (по 0,3 - 0,4 мл) н-гексана. Доводят объем в пробирке н-гексаном точно до 2 мл, перемешивают и аликвоту хроматографируют.

К 2 - 5 мл цельной крови, собранной в стаканы вместимостью 50 - 100 мл, прибавляют при непрерывном перемешивании стеклянной палочкой безводный сульфат натрия до образования сухой массы (20 г). Затем приливают 30 - 40 мл диэтилового эфира и 10 мин. перемешивают пробу с эфиром. Сливают эфир в колбу для отгонки растворителей, фильтруя через фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют еще раз. Эфирные экстракты объединяют, упаривают на ротационном испарителе при температуре бани 20 - 25 °C до объема 1 - 2 мл. Остаток упаривают досуха при комнатной температуре. К сухому остатку в колбе прибавляют 1 мл н-гексана и аликвоту хроматографируют.

Пробу мочи (20 мл) переносят в делительную воронку, разбавляют 20 мл дистиллированной воды, перемешивают и прибавляют 20 мл диэтилового эфира. Осторожно встряхивают 5 мин. и дают отстояться. Отделяют верхний эфирный слой, сливая его через безводный сульфат натрия. Операцию экстрагирования повторяют дважды. Объединенные экстракты переносят в колбу для отгонки растворителей и далее поступают так же, как при экстракции из крови.

Из 10 г (мл) средней пробы молока, яиц, органов и тканей гетерофос извлекают 50 мл смеси ацетона с этанолом (3:1). Экстрагируют при встряхивании в течение 20 мин., после чего экстракты помещают в морозильную камеру холодильника на 1 ч. Пробы фильтруют через бумажный фильтр в колбы для отгонки либо в фарфоровые чашки, промывают посуду и фильтр 20 мл экстрагирующей смеси. Фильтрат концентрируют под вакуумом на ротационном испарителе (температура бани 40 °C) или упаривают в фарфоровых чашках на водяной бане при температуре 40 °C в слабом токе теплого воздуха до объема 1 - 2 мл. Остатки фильтруют через бумажный фильтр в делительные воронки. Колбы для отгонки или фарфоровые чашки тщательно ополаскивают 10 мл смеси этанола с водой (1:3), фильтруют в те же делительные воронки, добавляют 25 мл дистиллированной воды и встряхивают 0,5 - 1 мин. Из водно-спиртового раствора гетерофос трижды экстрагируют гексаном порциями по 30 мл в течение 2 - 3 мин. при встряхивании. Объединенный гексановый экстракт сушат безводным сульфатом натрия, помещают в колбы для отгонки или в фарфоровые чашки и концентрируют до объема 0,5 мл. Оставшийся растворитель отгоняют досуха при комнатной температуре. Сухой остаток растворяют в 5 мл этилового спирта и аликвотную часть (2 - 3 мкл) хроматографируют.

    Условия  хроматографирования. Хроматограф марки "Цвет" с ТИД и

ДПР.  Колонка  стеклянная  спиральная длиной 1 м с диаметром 3 мм,

заполненная  хроматоном N-AW-HMDS (0,16 - 0,20 мм) с 5% SE-30 либо

инертоном-супер  N  (0,16  -  0,20  мм) с 3% OV-101. Рабочая шкала

                                      -10

электрометра  при  работе с ТИД 2 x 10    А, при работе с ДПР 20 x

  -12

10     A. Скорость протяжки диаграммной ленты 240 мм/ч. При работе

на ТИД расход газа-носителя (азота) 22 мл/мин., водорода - 14 - 17

мл/мин.,   воздуха   -  400  мл/мин.  При  работе  на  ДПР  расход

газа-носителя (азота) 60 мл/мин., расход на продувку детектора 150

мл/мин.  Температура  (°C):  испарителя  -  210,  детектора - 230,

колонки - 190 и 127.

Время удерживания и пределы обнаружения исследуемых соединений при указанных условиях определения методом ГЖХ приведены в таблице 30.

 

Таблица 30

 

ВРЕМЯ УДЕРЖИВАНИЯ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ТЕМПЕРАТУРАХ,

ПРЕДЕЛЫ ОБНАРУЖЕНИЯ И КОНЦЕНТРАЦИИ РАБОЧИХ РАСТВОРОВ

ГЕТЕРОФОСА, ЭТАФОСА И ИХ МЕТАБОЛИТОВ

 

┌───┬─────────────────┬──────┬──────────────┬───────┬────────────┬─────────┐

│ N │   Исследуемое   │Темпе-│    Время     │Относи-│Концентрация│Нижний   │

│п/п│   соединение    │ратура│ удерживания  │тельное│  рабочего  │предел   │

│   │                 │колон-├───────┬──────┤время  │  раствора  │обнаруже-│

│   │                 │ки, °C│  ТИД  │ ДПР  │удержи-│<*>, мкг/мл │ния, нг  │

│   │                 │      │       │      │вания  │            ├────┬────┤

│   │                 │      │       │      │       │            │ТИД │ДПР │

├───┴─────────────────┴──────┴───────┴──────┴───────┴────────────┴────┴────┤

│  Фаза - 5% SE-30 на хроматоне N-AW-HMDS, температура испарителя 210 °C   │

│                                                                          │

│1  │Гетерофос        │190   │3 мин. │-     │1      │0,2         │0,1 │-   │

│   │                 │      │36 с   │      │       │            │    │    │

│   │-"-              │127   │25 мин.│-     │1      │2,0         │1,0 │-   │

│2  │Этафос           │190   │10 мин.│4 мин.│2,95   │5,0         │1,2 │0,1 │

│   │                 │      │36 с   │30 с  │       │(0,1) <**>  │    │    │

│   │Метаболиты       │      │       │      │       │            │    │    │

│1  │O-Этил-O-        │190   │1 мин. │-     │0,42   │1,0         │0,2 │-   │

│   │фенилфосфат      │      │30 с   │      │       │            │    │    │

│2  │O-Этил-S-        │190   │54 с   │-     │0,25   │0,5         │0,1 │-   │

│   │пропилфосфат     │      │       │      │       │            │    │    │

│   │То же            │127   │6 мин. │-     │-      │-           │-   │-   │

│   │                 │      │15 с   │      │       │            │    │    │

│3  │O-Этил-O-фенил-S-│190   │2 мин. │-     │0,62   │0,5         │0,1 │-   │

│   │метилтиофосфат   │      │12 с   │      │       │            │    │    │

│4  │O-Этил-O-        │190   │2 мин. │-     │0,80   │3,0         │1,0 │-   │

│   │фенилтиофосфат   │      │48 с   │      │       │            │    │    │

│5  │O-Этил-0,2,4-    │190   │5 мин. │3 мин.│1,46   │5,0         │1,2 │0,2 │

│   │дихлорфенил-     │      │18 с   │24 с  │       │(1) <**>    │    │    │

│   │тиофосфат        │      │       │      │       │            │    │    │

│6  │O-метил-O-фенил- │190   │1 мин. │-     │0,53   │1,0         │0,2 │-   │

│   │S-пропилтиофосфат│      │54 с   │      │       │            │    │    │

│   │                 │190   │3 мин. │      │0,85   │            │    │    │

│7  │O-Этил-O-метил-  │127   │4 мин. │-     │0,19   │0,5         │0,2 │-   │

│   │S-пропилтиофосфат│      │42 с   │      │       │            │    │    │

│8  │O,O-Диметил-     │127   │3 мин. │-     │0,14   │0,5         │0,1 │-   │

│   │S-пропилтиофосфат│      │30 с   │      │       │            │    │    │

│9  │O-Этил-O-        │127   │2 мин. │-     │0,09   │2,0         │2,0 │-   │

│   │метилтиофосфат   │      │12 с   │      │       │            │    │    │

│10 │O,O-Диметил-     │127   │1 мин. │      │0,07   │2,0         │1,0 │-   │

│   │тиофосфат        │      │42 с   │      │       │            │    │    │

│                                                                          │

│     Фаза - 3% OV-101 на инертоне-супер, температура испарителя 225 °C    │

│                                                                          │

│1  │Гетерофос        │190   │2 мин. │-     │-      │0,1         │0,02│-   │

│   │                 │      │42 с   │      │       │            │    │    │

└───┴─────────────────┴──────┴───────┴──────┴───────┴────────────┴────┴────┘

 

--------------------------------

<*> Для удобства работы можно приготовить смеси, в которых концентрация каждого соединения соответствует его концентрации, указанной в таблице для рабочих растворов. Смесь I: гетерофос, метаболиты N 1, 2, 3, 4, 6. Смесь II: гетерофос, метаболит N 5. Смесь III: метаболиты N 7, 8, 9, 10.

<**> В скобках указана концентрация раствора при работе с ДПР.

 

Обработка результатов анализа. Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Для этого до и после анализа проб вводят в хроматограф по 3 - 5 мкл рабочих стандартных растворов. Измеряют высоту пиков и вычисляют среднее арифметическое из пяти определений. Если при введении в хроматограф аликвотной части (3 - 5 мкл) конечного экстракта пробы получаются слишком большие пики или происходит "зашкаливание", пробу разбавляют н-гексаном. Для определения гетерофоса и всех его метаболитов каждую пробу следует анализировать при двух температурах колонки (190 и 127 °C), используя соответствующие стандарты.

Содержание пестицида или его метаболитов в пробе (X, мг/кг, мг/л) рассчитывают по формуле:

 

                                  AV H VK

                                    2 1

                              X = -------,

                                   H V P

                                    2 1

 

    где:

    A   -   количество  пестицида  или  метаболита  в  стандартном

растворе, введенном в хроматограф, мкг/мл;

    V   -  объем  стандартного раствора, введенного в хроматограф,

     2

мкл;

    H    -   высота   пика  стандартного  раствора,  введенного  в

     2

хроматограф, мм;

    H  - высота пика исследуемого раствора, мм;

     1

    V  - объем экстракта, введенного в хроматограф, мкл;

     1

    V - объем анализируемого экстракта, мл;

    P - навеска или объем анализируемой пробы, г (мл);

    K  -  поправочный коэффициент, составляющий для мяса, молока и

яиц 1,2; 1,4; 1,5 соответственно.

Требования безопасности. Соблюдают общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями и токсичными веществами.