Утверждаю

Заместитель начальника Главного

санитарно-эпидемиологического

управления Минздрава СССР

А.И.ЗАИЧЕНКО

10 июля 1987 г. N 4398-87

 

ИНСТРУКЦИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ РИБОФЛАВИНА (ВИТАМИНА B2)

В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

 

Разработана в Институте питания АМН СССР лабораторией витаминизации пищевых продуктов.

 

Для определения общего содержания рибофлавина в пищевых продуктах используют флюориметрический метод, разработанный в двух вариантах (прямой флюорометрии и люмифлавиновый), прошедший широкую апробацию в лабораториях научно-исследовательских и практических учреждений при разработке справочных "Таблиц химического состава пищевых продуктов". Метод одобрен Минздравом СССР и рекомендован для практического использования Междуведомственной комиссией по составлению таблиц.

 

Принцип метода

 

Метод основан на свойстве свободного рибофлавина и продукта его фотолиза - люмифлавина - флюоресцировать при облучении их растворов светом с длиной волны 440 - 450 нм. В варианте прямой флюорометрии интенсивность флюоресценции измеряется до и после восстановления рибофлавина гидросернистокислым натрием. В люмифлавиновом варианте используется свойство рибофлавина при облучении в щелочной среде переходить в люмифлавин, интенсивность флюоресценции которого измеряют после извлечения его хлороформом.

 

Оборудование

 

Флюориметр ЭФ-3М или ФМ-Ц-2; потенциометр; термостат водяной на 37 °С; весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 200 г, поверочной ценой деления не более 0,5 мг; весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 500 г, поверочной ценой деления не более 50 мг; водяная баня.

Для люмифлавинового варианта дополнительно нужны две настольные лампы по 100 ватт (желательно с отражателями, направляющими свет на облучаемые колбы), настольный вентилятор.

 

Посуда

 

Колбы мерные вместимостью 100, 500, 1000 куб. см; колбы конические вместимостью 250 куб. см; колбы конические с притертой пробкой вместимостью 100 куб. см; бюретка на 100 куб. см; цилиндры мерные вместимостью 25 куб. см; пипетки градуированные на 1, 2, 5 и 10 куб. см; воронки делительные вместимостью 250 куб. см, воронки фильтровальные диаметром 3,5 см и 8 см.

 

Реактивы

 

1. Калий марганцевокислый, х.ч.

2. Натрий гидроокись, х.ч.

3. Натрий гидросернистокислый техн.

4. Натрий уксуснокислый 3-водн., х.ч.

5. Натрия сульфат безводный х.ч.

6. Перекись водорода 30%, х.ч.

7. Рибофлавин кристаллический (Гос. фармакопея СССР, X изд., ст. 585).

8. Кислота соляная, х.ч.

9. Кислота уксусная ледяная, х.ч.

10. Хлороформ для наркоза.

11. Ферментные препараты амилоризин П10х и пектаваморин П10х.

 

Приготовление реактивов

 

1. Стандартные растворы рибофлавина. Растворяют 0,0200 г рибофлавина, предварительно высушенного в эксикаторе над серной кислотой или пятиокисью фосфора в течение 10 дней, в мерной колбе вместимостью 1000 куб. см в 750 куб. см дистиллированной воды. Для лучшего растворения добавляют 1 куб. см ледяной уксусной кислоты и слегка подогревают. После полного растворения рибофлавина раствор охлаждают до комнатной температуры, доводят объем водой до метки и тщательно перемешивают (раствор с массовой концентрацией рибофлавина 0,020 г/куб. см). Переносят в склянку темного стекла с притертой пробкой, добавляют 0,5 куб. см толуола и сохраняют в темноте и на холоде не более 2-х месяцев. В день проведения анализа 5 куб. см этого раствора, нагретого в темноте до комнатной температуры, помещают в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят объем до метки водой, перемешивают (рабочий раствор с массовой концентрацией рибофлавина 1 мкг/куб. см).

2. Раствор соляной кислоты 0,1 н.

3. Насыщенный раствор натрия уксуснокислого.

4. Раствор калия марганцевокислого 3%.

5. Раствор перекиси водорода 3%, готовят свежий еженедельно.

6. Раствор гидроокиси натрия 7 н.

 

Ход определения

 

Интервал определяемых концентраций рибофлавина составляет при прямой флюорометрии 0,5 - 2 мкг/куб. см; при использовании люмифлавинового варианта - 0,03 - 0,20 мкг/куб. см. Величину навески продукта и последующие разведения рассчитывают исходя из интервала указанных концентраций.

Навеску мелкоизмельченной средней пробы продукта помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, приливают около 150 куб. см 0,1 н раствора соляной кислоты и кипятят на водяной бане 40 минут. Затем охлаждают до комнатной температуры, доводят рН гидролизата до 4,5 (потенциометрически) с помощью насыщенного раствора уксуснокислого натрия, добавляют 100 мг амилоризина, 0,5 куб. см толуола и помещают в термостат на 14 - 16 часов при 37 °С. На следующий день гидролизат охлаждают, доводят объем в мерном цилиндре до 250 куб. см дистиллированной водой и фильтруют. Если исследуемый объект содержит много жира, то навеску перед гидролизом обрабатывают серным эфиром; возможно также обработать эфиром уже готовый гидролизат.

При анализе объектов, содержащих много пектиновых веществ (яблоки, крыжовник, смородина, тыква, кабачки и продукты их переработки), вместо амилоризина используют пектаваморин. При необходимости прервать анализ на 1 - 2 дня перед доведением объема до 250 куб. см гидролизат кипятят 5 минут, охлаждают, доводят объем до 250 куб. см и фильтруют. До проведения анализа фильтрат хранят в холодильнике в хорошо закрытой склянке.

Одновременно аналогичным образом ставят контрольную пробу на содержание рибофлавина в ферментных препаратах, используя те же количества ферментных препаратов и реактивов. При анализе многих видов продуктов стадия гидролиза совпадает с аналогичной стадией анализа на содержание тиамина, что позволяет проводить определение рибофлавина и тиамина в одной навеске.

 

Вариант прямой флюорометрии

 

Метод прямой флюорометрии неприменим при анализе объектов с очень низким содержанием рибофлавина (некоторые овощи, плоды, ягоды), готовых блюд и кулинарных изделий, а также при исследовании зерновых продуктов (круп, муки, зерна, хлеба и т.д.). В этих случаях предпочтительным является люмифлавиновый вариант.

    В  4  флюорометрические пробирки  наливают  по  10  куб.  см  фильтрата

испытуемого  образца. В  2  пробирки  с  фильтратом  добавляют по 1 куб. см

дистиллированной   воды,  в  2  другие  -  по  1  куб.  см  (очень  точно!)

стандартного  раствора, содержащего 1 мкг  рибофлавина в 1  куб. см.  В 5-ю

пробирку наливают 10 куб. см фильтрата контрольной пробы  к 1 куб. см воды.

Во все  пробирки  добавляют  по  1  куб.  см  ледяной  уксусной  кислоты  и

перемешивают содержимое.  Затем  вносят по 0,5 куб. см  3% раствора  KMnO ;

                                                                         4

смешивают и оставляют на 2 мин. Добавляют в каждую  пробирку по 0,5 куб. см

энергично 3% раствора H O  и встряхивают для удаления избытка кислорода.

                       2 2

    Измеряют флюоресценцию всех растворов на флюориметре со светофильтрами,

имеющими максимум пропускания в области 350 - 480 нм (В  - первичный) и 510

                                                       2

- 550  нм  (В   -  вторичный).  После  этого  добавляют  в  каждую пробирку

             2

небольшими  порциями (по  15 - 25 мг)  порошкообразный  гидросернистокислый

натрий, перемешивают и в течение 5 - 10 сек. вновь  измеряют  флюоресценцию

растворов. Повторяют эту операцию быстро  еще раз,  не допуская  помутнения

растворов за счет выделения свободной серы.

Для расчетов используют средние показания двух параллельных пробирок до и после добавления гидросернистокислого натрия. В последнем случае берут наименьшие значения флюоресценции, полученные при повторном восстановлении рибофлавина гидросернистокислым натрием. Содержание рибофлавина в исследуемом образце в мг на 100 г (Х) вычисляют по следующей формуле:

 

                       [(А - А ) - (С - С )] х V х n

                              1          1

                Х = -----------------------------------,

                    [(В - В ) - (А - А )] х V  х а х 10

                           1          1      1

 

    где:

    А  -  интенсивность  флюоресценции  исследуемого образца без добавления

стандартного раствора рибофлавина;

    А  - то  же  после   восстановления   рибофлавина   гидросернистокислым

     1

натрием;

    В  -  интенсивность флюоресценции  исследуемого  образца  с добавлением

стандартно раствора рибофлавина;

    В  - то  же   после  восстановления   рибофлавина   гидросернистокислым

     1

натрием;

    С - интенсивность флюоресценции контрольного опыта;

    С  - то же после добавления гидросернистокислого натрия;

     1

    V - объем гидролизата (куб. см);

    V  -  количество  гидролизата, взятое для окисления перманганатом калия

     1

(куб. см);

    n - количество добавленного рибофлавина (мкг);

    а - навеска образца (г);

    10 - коэффициент пересчета из мкг/г в мг/100 г продукта.

 

                          Люмифлавиновый вариант

 

    К  100 мл  фильтрата добавляют 2 куб. см 30% раствора серной кислоты из

пипетки  3% раствора  KMnO  по каплям,  постоянно перемешивая, до получения

                          4

малинового  окрашивания.  Через  одну  минуту  избыток  перманганата  калия

удаляют добавлением по каплям 3%  раствора  перекиси  водорода.  Количество

куб.  см   израсходованных   перманганата   калия   и   перекиси   водорода

приплюсовывают к  первоначально  взятому  на  окисление  объему  фильтрата,

чтобы определить конечный объем раствора.

    Например: на  окисление 100 куб. см фильтрата израсходовано 1,8 куб. см

KMnO  и 0,2 куб. см H O . Конечный объем будет 100 куб. см + 2 куб. см  30%

    4                2 2

серной кислоты + 1,8 куб. см + 0,2 куб. см = 104 куб. см.

Полученный раствор переносят в делительную воронку, добавляют 30 - 50 куб. см хлороформа и встряхивают 1 мин. После разделения слоев хлороформный слой отбрасывают, а водную фазу используют для дальнейшего определения. Одновременно аналогичным образом обрабатывают контрольную пробу, содержащую те же количества ферментных препаратов и реактивов, но без исследуемого образца.

В 4 конические колбы с притертыми пробками наливают по 20 куб. см экстракта исследуемого образца. В 2 из них добавляют по 2 куб. см рабочего стандартного раствора рибофлавина, с массовой концентрацией 1 мкг в 1 куб. см. В 5-ю коническую колбу наливают 20 куб. см контрольной пробы. Во все колбы добавляют по 4 куб. см 7 н раствора едкого натра, закрывают пробками, перемешивают и облучают их 40 мин. светом двух настольных ламп по 100 ватт с расстояния 30 см. Температура окружающего воздуха не должна превышать 25 °С, для охлаждения используют настольный вентилятор. Немедленно после окончания облучения все растворы подкисляют 4 куб. см ледяной уксусной кислоты, добавляют по 20 куб. см хлороформа, закрывают притертыми пробками и встряхивают колбы в течение 2-х минут, избегая образования эмульсии. Оставляют все колбы на 10 - 15 минут для расслоения водной и хлороформной фаз. С помощью пипетки с резиновой грушей или небольшой делительной воронки отбирают по 10 - 12 куб. см хлороформного раствора, который фильтруют через бумажный фильтр с безводным сернокислым натрием в флюорометрические пробирки.

Измеряют флюоресценцию полученных таким образом хлороформных растворов на флюориметре, используя те же светофильтры, которые указаны в варианте прямой флюорометрии.

Содержание рибофлавина (мг на 100 г продукта) вычисляют по формуле:

 

                           (А - А ) х К х V х V

                                 1             1

                    Х = ---------------------------,

                        (А  - А) х а х V  х V  х 10

                          2             2    3

 

    где:

    А  -  среднее  из  показаний  флюориметра  для  испытуемого образца без

добавления стандартного раствора рибофлавина;

    А  - то же для контрольного опыта на реактивы;

     1

    А  -  среднее  из  показаний  флюориметра  для  исследуемого  образца с

     2

добавлением стандартного раствора рибофлавина;

    К - количество добавленного рибофлавина (мкг);

    V - общий объем гидролизата (куб. см);

    V  - объем гидролизата после окисления (куб. см);

     1

    V  - объем гидролизата, взятый на окисление (куб. см);

     2

    V  - объем гидролизата, взятый на облучение (куб. см);

     3

    а - навеска продукта (г);

    10 - коэффициент пересчета из мкг/г в мг/100 г продукта.

Вычисления проводят до второго знака после запятой. Расхождение между двумя параллельными определениями не должно превышать 10% от среднего арифметического значения.