Утверждены

Минздравом СССР

8 июня 1989 г. N 4999-89

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ РОНИТА И ЕГО МЕТАБОЛИТОВ

В БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ МЕТОДАМИ ТОНКОСЛОЙНОЙ

И ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>

 

--------------------------------

<*> Разработаны Л.Г. Александровой (КНИИГТ и ПЗ).

 

    Краткая      характеристика      препарата.       Ронит - S,N-диэтил-N-

циклогексилтиокарбамат. Брутто-формула C  H  NOS. Молекулярная масса 215,4.

                                        11 21

Светло-желтая  маслянистая  жидкость  с  т. кип. 145 - 146 °C  при 1300 Па.

Хорошо растворим в большинстве органических  растворителей. Растворимость в

воде при 22 °C 100 мг/л. Применяется в качестве гербицида в посевах свеклы.

Принцип метода. Метод основан на экстракции ронита из биологических сред органическим растворителем (хлороформ, гексан) и последующем определении методами тонкослойной (ТСХ) и (или) газожидкостной (ГЖХ) хроматографии. В методе ТСХ используется подвижная фаза на основе гексана, проявляющие реагенты - бромфеноловый синий с нитратом серебра, 2,6-дибром-N-хлорхинонимин или реактив Драгендорфа. В методе ГЖХ используют ТИД, неподвижные фазы SE-30, XE-60, DC-550.

Метрологическая характеристика метода. Метрологическая характеристика метода приведена в таблице 90.

 

Таблица 90

 

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ

РОНИТА В БИОСРЕДАХ (n = 5 и p = 0,95)

 

┌────────────────┬─────┬──────────────┬────────┬───────────┬──────────────┐

│ Анализируемый  │Метод│Нижний предел │Среднее │Стандартное│Доверительный │

│     объект     │     │ обнаружения, │значение│отклонение,│   интервал   │

│                │     │мкг/мл, мкг/г,│опреде- │     %     │   среднего   │

│                │     │  мкг/кв. см  │ления, %│           │определения, %│

├────────────────┼─────┼──────────────┼────────┼───────────┼──────────────┤

│Желудочный сок, │ГЖХ  │0,02          │91,9    │+/- 5,5    │+/- 6,8       │

│слюна           │ТСХ  │0,25          │81,2    │+/- 8,2    │+/- 10,2      │

│Желчь           │ГЖХ  │0,02          │86,8    │+/- 6,4    │+/- 7,9       │

│                │ТСХ  │0,25          │77,6    │+/- 8,2    │+/- 0,2       │

│Моча            │ГЖХ  │0,0008        │92,8    │+/- 5,4    │+/- 6,7       │

│                │ТСХ  │0,01          │85,0    │+/- 7,6    │+/- 9,4       │

│Кровь           │ГЖХ  │0,04          │89,8    │+/- 5,9    │+/- 7,3       │

│                │ТСХ  │0,5           │85,4    │+/- 8,5    │+/- 10,5      │

│Кожа            │ГЖХ  │0,04          │90,1    │+/- 5,5    │+/- 6,9       │

│                │ТСХ  │0,5           │83,4    │+/- 8,1    │+/- 10,1      │

│Смывы с         │ГЖХ  │0,002         │92,9    │+/- 5,15   │+/- 6,4       │

│поверхности кожи│ТСХ  │0,03          │85,0    │+/- 7,16   │+/- 8,9       │

└────────────────┴─────┴──────────────┴────────┴───────────┴──────────────┘

 

Избирательность метода. Определению ронита не мешают пестициды, которые могут присутствовать в пробе: диазинон, эптам, метоксихлор, линдан.

Реактивы, растворы, материалы. Ронит х.ч. Ацетон х.ч. Гексан ч. Хлороформ х.ч. Натрия цитрат х.ч., 5-процентный водный раствор. Сульфат натрия безводный ч.д.а. Нитрат серебра х.ч., 0,5-процентный водно-ацетоновый раствор (1 часть воды + 3 части ацетона). Бромфеноловый синий х.ч. Лимонная кислота х.ч., 2-процентный раствор. Нитрат висмута основной ч. Йодид калия х.ч. Серная кислота х.ч., 40-процентный и 20-процентный растворы. Проявляющие реагенты: N 1 - бромфеноловый синий. Взвешивают 50 мг бромфенолового синего, растворяют в 10 мл ацетона и доводят объем раствора до 100 мл 0,5-процентным водно-ацетоновым раствором нитрата серебра. Срок хранения в холодильнике до 1 мес.; N 2 - 2,6-дибром-N-хлорхинонимин х.ч., 0,5-процентный раствор в гексане. Хранят в темной склянке в холодильнике до 1 мес.; N 3 - реактив Драгендорфа. Взвешивают 0,85 г нитрата висмута, приливают 40 мл воды и 10 мл 40-процентного раствора серной кислоты. К полученному раствору прибавляют раствор, содержащий 8 г йодида калия в 20 мл воды. Для опрыскивания хроматографических пластинок к 6 мл исходного раствора приливают 6 мл 20-процентной серной кислоты и 6 мл воды. Исходный раствор можно хранить в холодильнике несколько месяцев.

Оксид алюминия II степени активности для хроматографии. Сульфат кальция безводный ч.д.а. (или гипс медицинский). Хроматографические пластинки "Силуфол" размером 15 x 15 см. Приготовление хроматографических пластинок с оксидом алюминия: 50 г оксида алюминия, просеянного через сито 100 меш, смешивают с 5 г безводного сульфата кальция и 75 мл воды, встряхивают до образования однородной массы. Наливают тонким слоем на 10 стеклянных пластинок размером 9 x 12 см или на 7 - 8 пластинок размером 12 x 15 см. Этанол х.ч. Подвижная фаза: гексан-эфир (3:1) для оксида алюминия; гексан-бензол (7:12), гексан-ацетон (4:1) или гексан-эфир (2:1) для пластинок "Силуфол". Азот, водород в баллонах с редукторами. Насадка хроматографической колонки: хроматон N-AW-DMCS (0,16 - 0,20 мм) с 5% SE-30 либо с 5% XE-60 или 5% DC-550. Бензол х.ч. Диэтиловый эфир х.ч. Вата гигроскопическая, обезжиренная. Приготовление стандартного раствора ронита в хлороформе и гексане с содержанием действующего вещества 100 мкг/мл. Вначале готовят исходный раствор. Для этого взвешивают мерную колбу с небольшим количеством растворителя на аналитических весах. Затем вносят несколько капель пестицида и снова взвешивают. Разница в навеске соответствует массе растворенного вещества. Вычисляют содержание пестицида в 1 мл после доведения растворителем объема раствора в колбе до метки. Из исходного раствора готовят соответствующим разбавлением раствор, содержащий 100 мкг/мл препарата, а из него для ГЖХ - растворы, содержащие 10; 2 и 0,2 мкг/мл препарата.

Приборы, аппаратура, посуда. Ротационный вакуумный испаритель с набором колб. Газовый хроматограф с ТИД. Аппарат для встряхивания. Термостат. Колбы: мерные; грушевидные (для отгонки растворителей). Цилиндры. Пипетки, микропипетки. Стаканы, склянки химические на 50 - 100 мл. Воронки: химические, делительные. Насадка для перегонки с водяным паром (рис. 7 - не приводится). Хроматографическая камера. Пульверизатор стеклянный. Баня водяная. Стеклянные капилляры для нанесения на хроматографические пластинки. Стеклянные пластинки размером 9 x 12 см или 12 x 15 см. Микрошприцы на 10 мкл. Колонки хроматографические длиной 1 м, внутренним диаметром 3 мм. Секундомер. Линейка и лупа измерительная. Микроизмельчитель тканей РТ-2.

Ход анализа. Экстракция и очистка экстрактов. К 2 мл пробы из желудочного сока, желчи, слюны приливают 0,5 мл дистиллированной воды, 3 мл гексана (анализ методом ГЖХ) или 3 мл хлороформа (анализ методом ТСХ) и встряхивают в делительной воронке на холоде в течение 30 - 40 мин. Органический слой отделяют, экстракцию проводят еще дважды свежими порциями растворителя. Порции органического растворителя объединяют, обезвоживают безводным сульфатом натрия, отгоняют при комнатной температуре до объема растворителя 1 мл для ГЖХ и 0,2 - 0,5 мл для ТСХ.

Пробу крови (1 мл) отбирают в пробирку, смоченную нитратом натрия, приливают 3 мл гексана или хлороформа и встряхивают в течение 30 - 40 мин. Далее поступают так, как описано выше.

К 20 - 50 мл пробы мочи приливают 2 - 5 мл воды, 5 - 10 мл гексана или хлороформа и экстрагируют, осторожно встряхивая в течение 40 мин. Далее поступают так, как описано выше.

Пробу кожи предварительно выдерживают в морозильнике 1 - 2 ч. Затем пробу массой 1 г тщательно измельчают, приливают 4 мл хлороформа или гексана и встряхивают в течение 50 - 60 мин. Органический слой отделяют. Экстракцию повторяют еще дважды свежими порциями растворителя. Объединенный экстракт сушат безводным сульфатом натрия и далее поступают так, как описано выше.

Смыв с поверхности кожи проводят ватным тампоном, смоченным дистиллированной водой или этанолом. Тампон помещают в склянку, приливают 20 мл воды так, чтобы весь тампон был покрыт водой. Встряхивают в течение 60 мин. Экстракт сливают, отжимают вату. Промывают вату свежей порцией воды. К объединенному водному экстракту приливают 10 мл гексана (или хлороформа) и экстрагируют перемешиванием растворов в течение 30 - 40 мин. Органический слой отделяют так, как описано выше.

    Ход  анализа  при  ТСХ.  Пробу  0,2  -  0,5 мл количественно наносят на

хроматографическую  пластинку,  параллельно  на  эту  же  пластинку наносят

стандартные   растворы   ронита,  содержащие  0,5  -  10  мкг.  Помещают  в

хроматографическую  камеру,  куда  предварительно  наливают подвижную фазу.

После поднятия фронта растворителя на высоте 10 - 12 см пластинку извлекают

из  камеры и дают улетучиться следам растворителей. Затем применяют один из

проявляющих  реагентов.  Если  хроматографирование  проводят  на пластинках

"Силуфол",   то  используют  проявляющие  реагенты  N  1  или  N  2.  После

опрыскивания  проявляющим  реагентом  N  1  пластинку  сразу  же помещают в

термостат  при  температуре  60 - 80  °C  на  15 мин.   Затем  обрабатывают

2-процентным раствором лимонной  кислоты.  На  желтом  фоне  пластинки зона

локализации ронита  окрашивается  в  синий цвет. Если пластинку опрыскивают

проявляющим  реагентом  N 2,  то пластинку  после этого следует поместить в

термостат при 110 - 115 °C  на 3 - 5 мин.  Зона  локализации  ронита  и его

метаболитов - сульфоксида и сульфона - окрашивается в  лимонно-желтый цвет.

Величина R  ронита  0,56,  сульфоксида - 0,18, сульфона - 0,35. Проявляющий

          f

реагент N 3  применяют  при  хроматографировании  на  пластинках  с оксидом

алюминия.   В  этом  случае  тотчас  после  опрыскивания   реагентом   зона

локализации   ронита   окрашивается  в  красно-коричневый   цвет,   а   его

метаболитов  -  в  голубовато-сиреневый  (ЦГА),   вишнево-красный   (ДЦГА),

экстрактивных  веществ  биосред  -  в  желтый.  Величина  R   ронита  0,75,

                                                           f

ЦГА - 0,1, ДЦГА - 0,4.

Ход анализа при ГЖХ. Вводят в хроматограф 2 - 5 мкл из 1 мл очищенного гексанового экстракта. Условия газохроматографического определения приведены в таблице 91.

 

Таблица 91

 

УСЛОВИЯ ХРОМАТОГРАФИРОВАНИЯ НА РАЗЛИЧНЫХ КОЛОНКАХ

 

┌─────────────────────────────┬─────────────┬────────────┬────────────────┐

│          Параметры          │  I колонка  │ II колонка │  III колонка   │

│                             │  5% SE-30   │  5% XE-60  │   5% DC-550    │

├─────────────────────────────┼─────────────┴────────────┴────────────────┤

│Носитель                     │Хроматон N-AW-DTCS (0,16 - 0,20 мм)        │

│Детектор                     │ТИД          │ТИД         │ТИД             │

│Колонка - длина/диаметр, м/мм│1/3          │1/3         │1/3             │

│Температура, °C:             │             │            │                │

│  колонки                    │160          │140         │160             │

│  испарителя                 │210          │200         │200             │

│Расход газа, мл/мин.:        │             │            │                │

│  азота                      │20           │20          │20              │

│  водорода                   │15           │15          │15              │

│  воздуха                    │200          │400         │400             │

│                             │       -12   │       -12  │        -12     │

│Чувствительность шкалы       │50 x 10      │50 x 10     │100 x 10        │

│электрометра, А              │             │            │                │

│Минимально детектируемое     │0,2          │2           │2               │

│количество, нг               │             │            │                │

│Время удерживания, мин.      │4,8          │7,1         │15,9            │

└─────────────────────────────┴─────────────┴────────────┴────────────────┘

 

Обработка результатов анализа. Определение методом ТСХ. С помощью промасленной миллиметровой бумаги измеряют площадь пятен на хроматограмме пробы и стандартных растворов, наиболее близких по размерам к пробе. Содержание ронита (X, мкг/мл или мкг/г) рассчитывают по формуле:

 

                                       A

                                   X = -,

                                       P

 

где:

A - количество вещества на хроматограмме пробы, найденное путем сравнения со стандартом, мкг;

P - масса пробы, мл, г.

Определение методом ГЖХ. Количественную оценку результатов проводят методом абсолютной калибровки. Для этого вводят в хроматограф стандартные растворы ронита (2 - 5 мкл), содержащие 0,2 - 20 мкг/мл. Строят градуировочный график зависимости "площадь пика - концентрация" и по нему находят концентрацию ронита в хроматографируемой пробе. Можно воспользоваться формулой, в которую вводят площадь пика на хроматограмме стандарта, наиболее близкого по размерам к пробе. При анализе проб параллельное определение каждой пробы проводят не менее 3 раз.

Расчет концентрации пестицида в исследуемой биологической пробе (X, мкг/мл или мкл/г) проводят по формуле:

 

                                   C  S  V

                                    ст пр 1

                               X = --------,

                                    S  VP

                                     ст

 

    где:

    C   - концентрация пестицида на хроматограмме стандарта, мкг;

     ст

    S   - площадь пика на хроматограмме пробы, кв. мм;

     пр

    S   - площадь пика на хроматограмме стандарта, кв. мм;

     ст

    V  - общий объем экстракта пробы, мл;

     1

V - хроматографируемый объем экстракта, мл;

P - масса или объем пробы, г или мл.

Требования безопасности. Необходимо соблюдать требования безопасности при работе с ядовитыми веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.