Утверждены

Минздравом СССР

8 июня 1989 г. N 5004-89

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ДЕЙСТВУЮЩЕГО ВЕЩЕСТВА ПРЕПАРАТА ТОРК

И ЕГО МЕТАБОЛИТА В ВОДЕ, ПОЧВЕ И РАСТИТЕЛЬНОМ МАТЕРИАЛЕ

МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>

 

--------------------------------

<*> Разработаны В.Н. Кавецким, Л.И. Бублик, В.А. Лесовой (УкрНИИЗР), Г.О. Оганесяном, Ю.А. Бунятяном (Филиал ВНИИГИНТОКС).

 

    Торк  (оксид  фенбутатина) - акарицид. Действующее вещество препарата -

ди[трис(2-диметил-2-фенилэтилового)олова]оксид.  Брутто-формула C  H  OSn .

                                                                 60 78   2

Молекулярная масса 1052. Химически чистое вещество представляет собой белый

кристаллический  порошок с т. пл. 138 - 139,5 °C, хорошо растворимый в ряде

органических  растворителей (ксилол, толуол, бензол, гексан, ацетон и др.),

практически  не  растворимый  в  воде,  нелетуч.  В  воде  гидролизуется  с

образованием    трис(2-метил-2-фенил)пропилоловогидроксида,   который   при

комнатной температуре переходит опять в исходное вещество.  Разрушается под

действием  сильных  окислителей. Препарат торк малотоксичен, ЛД   для белых

                                                               50

крыс 2500 мг/кг (орально).

Принцип метода. Метод основан на извлечении торка из воды, яблок хлористым метиленом, хлороформом, петролейным эфиром или торка совместно с метаболитом из воды, яблок, цитрусовых, огурцов смесью хлороформ-уксусная кислота (75:1), очистке экстрактов на колонках с силикагелем КСК или оксидом алюминия и хроматографировании в тонком слое с последующим обнаружением зон локализации соединений путем обработки гематоксилином, пирокатехиновым фиолетовым, кверцетином, дитизоном.

Метрологическая характеристика метода приведена в таблице 47.

 

Таблица 47

 

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА (p = 0,95, n = 5)

 

┌─────────┬───────────┬────────┬───────┬────────┬──────────┬──────────────┐

│Пластинка│Анализируе-│Анализи-│Предел │Объем   │Диапазон  │   Среднее    │

│         │мый объект │руемое  │обнару-│(масса) │определяе-│   значение   │

│         │           │соеди-  │жения, │анализи-│мых кон-  │определения, %│

│         │           │нение   │мкг    │руемой  │центраций │              │

│         │           │<*>     │       │пробы,  │мг/кг,    │              │

│         │           │        │       │мл, г   │мг/л      │              │

├─────────┼───────────┼────────┼───────┼────────┼──────────┼──────────────┤

│"Силуфол"│Вода       │Т       │3      │50      │0,06 - 0,2│93,05 +/- 2,57│

│УФ       │           │М       │2,5    │50      │0,06 - 0,2│99,0 +/- 1,57 │

│  254    │           │        │       │        │          │              │

│         │Яблоки,    │Т       │2      │50      │0,08 - 0,4│97,55 +/- 4,38│

│         │цитрусовые,│        │       │        │          │              │

│         │огурцы     │М       │3      │25      │0,12 - 0,4│91,0 +/- 2,96 │

│Силика-  │Почва      │Т       │2,5    │50      │0,05 - 0,4│86,0 +/- 3,8  │

│гель     │Яблоки     │Т       │10     │50      │0,2 - 0,4 │81,8 +/- 6,1  │

└─────────┴───────────┴────────┴───────┴────────┴──────────┴──────────────┘

 

--------------------------------

<*> Т - торк, М - метаболит торка.

 

Избирательность метода. Определению не мешают препараты акрекс, кельтан, антио, рогор, применяемые, как и торк, против растительноядных клещей. Определению могут мешать оловоорганические препараты, например пликтран и его метаболиты.

    Реактивы  и  растворы. Ацетон х.ч. Уксусная кислота ледяная х.ч. Гексан

х.ч.  Хлороформ х.ч. Хлороводородная кислота ч.д.а.,  0,2 н водный раствор.

Метилен  хлористый  ч.  Серная  кислота  ч.д.а.,  0,2  н  водный   раствор.

Петролейный  эфир  (используется  только  фракция  с т. кип. 40 - 60 °C) ч.

Пирокатехиновый  фиолетовый  (индикатор) ч.д.а.,  0,1-процентный  раствор в

этиловом спирте.  Лимонная  кислота х.ч.,  0,5-процентный  водный  раствор.

Гематоксилин х.ч., 0,1-процентный  раствор  в  этиловом  спирте.  Кверцетин

х.ч.,  0,1-процентный  раствор в этиловом  спирте.  Вода  дистиллированная.

Натрия  сульфат безводный ч.д.а.  Углерод четыреххлористый  ч.д.а.  Дитизон

ч.д.а.,  0,01-процентный  раствор  в  четыреххлористом   углероде.   Анилин

хлороводородный ч.д.а., 0,02-процентный водный раствор. Этиловый спирт х.ч.

Бумажные  фильтры  обеззоленные ("синяя лента"). Силикагель КСК. Силикагель

Silpearl (Чехословакия) для тонкослойной хроматографии.  Хроматографические

пластинки "Силуфол" УФ   .  Алюминия  оксид  для  хроматографии  II степени

                      254

активности.  Стандартные растворы торка и его метаболита с содержанием 10 и

100 мкг  в  1  мл  смеси  ацетон-уксусная кислота  (75:1), готовят  из х.ч.

веществ.

Приборы и посуда. Весы технические типа ВЛКТ. Весы аналитические типа ВЛДП. Аппарат для встряхивания жидкости в лабораторной посуде. Испаритель ротационный ИР-1М или другого типа. Камера для хроматографирования. Пульверизатор стеклянный. Осветитель ультрафиолетовый. Баня водяная. Плита электрическая. Колбы: мерные на 25 и 100 мл; конические ТС на 50; 100 и 250 мл; круглодонные на 100 мл. Цилиндры мерные на 10; 20; 50; 100 и 250 мл. Воронки лабораторные. Стаканы химические ТС на 50 и 100 мл. Хроматографические колонки стеклянные диаметром 1,5 см и длиной 30 см. Воронки делительные на 250 мл. Пипетки на 0,1; 1; 5; 15 и 20 мл. Ртутно-кварцевая лампа ПРК-2 или ПРК-4. Пластинки стеклянные для хроматографии размером 9 х 12 см.

Подготовка к определению. Приготовление растворов. Стандартные растворы торка и его метаболита (100 мкг/мл). 25 мг х.ч. вещества помещают в мерную колбу на 25 мл и растворяют смесью ацетон-уксусная кислота (75:1). Отбирают 10 мл раствора в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки смесью ацетона с уксусной кислотой (75:1).

Стандартные растворы торка и его метаболита (10 мкг/мл). Из стандартного раствора торка и его метаболита (100 мкг/мл) отбирают 10 мл в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки смесью ацетона с уксусной кислотой (75:1). Растворы хранят в прохладном защищенном от света месте не дольше 1 мес.

0,1-процентный раствор гематоксилина в 95-процентном этиловом спирте. 0,1 г гематоксилина помещают в колбу на 100 мл, добавляют 1 каплю концентрированной хлороводородной кислоты и доводят до метки 95-процентным этиловым спиртом. Раствор хранят в темной склянке не дольше недели.

0,1-процентный раствор пирокатехинового фиолетового. 0,1 г пирокатехинового фиолетового растворяют в 100 мл этилового спирта. Раствор хранят в темной склянке не дольше недели.

0,1-процентный раствор кверцетина в 96-процентном этиловом спирте. Кверцетин (0,5 г) растворяют в 300 мл этилового спирта при слабом нагревании, охлаждают, добавляют 25 мл концентрированной хлороводородной кислоты и доводят объем до 500 мл этиловым спиртом. Раствор хранят в темной склянке не дольше недели.

0,01-процентный раствор дитизона в четыреххлористом углероде. Свежеприготовленный 0,01-процентный раствор дитизона в четыреххлористом углероде с последующей обработкой 0,02-процентным раствором хлороводородного анилина хранят в темном и прохладном месте, используя не дольше двух дней.

0,5-процентный раствор лимонной кислоты. Лимонную кислоту (0,5 г) растворяют в 99,5 мл дистиллированной воды. Раствор хранят не дольше 1 мес.

0,2 н раствор серной кислоты. Концентрированную серную кислоту (5,56 мл) разбавляют водой до 1 л. Хранят в сухом прохладном месте не дольше 3 мес.

Приготовление хроматографической колонки с силикагелем. Стеклянную колонку размером 1,5 х 30 см, снабженную краном и стеклянным фильтром, заполняют на 25 см силикагелем КСК (0,7 мм). Колонку перед употреблением промывают смесью хлороформа с уксусной кислотой (75:1).

Приготовление хроматографических пластинок. 20 г силикагеля смешивают в стеклянном стаканчике с 29 мл 0,5 н уксусной кислоты и перемешивают в течение 15 мин. стеклянной палочкой. Смесь наносят на три стеклянные пластинки размером 9 х 12 см. Сушат на воздухе 14 - 15 ч. Пластинку "Силуфол" помещают в хроматографическую камеру с 0,5 н уксусной кислотой. После того как растворитель поднимется до верхнего края, пластинку вынимают и сушат 1 ч на воздухе.

Приготовление колонки с оксидом алюминия. Оксид алюминия II степени активности, нейтральный (100 г) помещают в коническую колбу на 250 мл, добавляют 6 мл дистиллированной воды и перемешивают при встряхивании в течение 7 ч.

В хроматографическую колонку вкладывают ватный тампон, затем насыпают оксид алюминия слоем высотой 7 см и пропускают 20 - 25 мл растворителя (хлористый метилен, хлороформ).

Ход анализа. Экстракция, очистка экстрактов и хроматографирование. Пробу воды (50 мл) переносят в коническую колбу на 250 мл и заливают 15 мл смеси хлороформа с уксусной кислотой (75:1) (для определения торка и его метаболита) или 15 мл органического растворителя: хлороформ, хлористый метилен, петролейный эфир (для определения торка). Экстрагируют на встряхивателе в течение 5 - 10 мин. Переносят смесь в делительную воронку и разделяют водный слой. Органическую фракцию собирают в отдельную колбу вместимостью 50 мл. Водный слой еще трижды экстрагируют тем же экстрагентом (порциями по 15 мл) и снова собирают в ту же колбу. Объединенные экстракты фильтруют через фильтр с безводным сульфатом натрия. Отгоняют растворитель на ротационном испарителе и остаток наносят на хроматографическую пластинку, обработанную уксусной кислотой. Рядом наносят стандартные растворы торка и метаболита, содержащие 1 - 5 мкг соединений, и хроматографируют в системе подвижных растворителей гексан-ацетон (4:1). После того как растворители поднимутся на высоту 10 см, пластинку вынимают, сушат на воздухе 30 мин. и проявляют хроматограмму.

Воздушно-сухую измельченную почву (50 г) помещают в коническую колбу и заливают 100 мл органического растворителя. Экстрагируют торк при встряхивании в течение 15 мин. Затем экстракт отделяют и фильтруют через бумажный фильтр с безводным сульфатом натрия. Экстракцию в течение 7 - 10 мин. повторяют еще дважды, заливая по 50 мл растворителя. Объединенные экстракты упаривают на роторном испарителе до небольшого объема (1 - 2 мл). Остаток наносят количественно полоской с левой стороны на пластинку размером 9 х 12 см с силикагелем и хроматографируют в подвижной фазе гексан-ацетон (4:1). Когда фронт растворителей поднимется на высоту 10 см, пластинку вынимают, сушат на воздухе 30 мин., затем поворачивают пластинку против часовой стрелки на 90°, слева наносят стандартный раствор, содержащий 1 - 5 мкг торка, и хроматографируют в той же подвижной фазе. После того как растворители поднимутся на высоту 10 см, пластинку вынимают, сушат на воздухе 1 ч и проявляют хроматограмму.

Измельченный растительный материал (яблок, цитрусовых, огурцов) (25 г) помещают в коническую колбу на 250 мл и заливают 50 мл смеси органического растворителя с уксусной кислотой (75:1). Экстрагируют на встряхивателе в течение 5 мин. Экстракт отделяют, а растительный материал экстрагируют еще трижды порциями растворителя по 15 - 20 мл. Объединенные экстракты пропускают через колонку с силикагелем КСК, собирая элюат в колбу прибора для отгонки растворителя и упарив до 1 - 2 мл, остаток наносят на хроматографическую пластинку. Экстракты можно очищать также, предварительно упарив пробу до 1 - 2 мл, внеся остаток в подготовленную колонку с оксидом алюминия и промыв ее 50 мл хлороформа. Элюат упаривают до 1 - 2 мл и наносят на хроматографическую пластинку. Рядом наносят стандартные растворы торка и его метаболита, содержащие 1 - 5 мкг соединений, и хроматографируют в подвижной фазе гексан-ацетон (4:1). После того как растворитель поднимется на высоту 10 см, пластинку вынимают, сушат на воздухе 1 ч и проявляют хроматограмму одним из четырех способов: 1) опрыскивание 1 мл 0,1-процентного раствора гематоксилина в 95-процентном этиловом спирте, УФ-облучение в течение 5 мин. и опрыскивание 1 мл 0,5-процентного водного раствора лимонной кислоты; 2) УФ-облучение в течение 10 мин. и опрыскивание 1 мл 0,1-процентного этанольного раствора пирокатехинового фиолетового; 3) опрыскивание 1 мл 0,2 н раствора серной кислоты, УФ-облучение в течение 10 мин. и опрыскивание 1 мл 0,1-процентного этанольного раствора кверцетина; 4) опрыскивание 1 - 2 мл 0,01-процентного раствора дитизона в четыреххлористом углероде, опрыскивание 0,02-процентным раствором (1 - 2 мл) хлороводородного анилина.

    При   наличии   торка  и  его  метаболита  в  пробе  на  хроматограмме,

обработанной гематоксилином, зоны локализации соединений проявляются в виде

сиреневых  пятен на голубом фоне; при обработке  пирокатехиновым фиолетовым

- в виде синих пятен на светло-коричневом фоне; кверцетином - в виде желтых

пятен  на  светлом  фоне; дитизоном - в виде желтых пятен на бледно-розовом

фоне. Величины R  торка и его метаболита равны соответственно 0,66 +/- 0,01

                f

и  0,37  +/-  0,01. Содержание торка и его метаболита в пробе находят путем

сравнения  размеров  и  интенсивности  окраски  пятен с пятнами стандартных

растворов.

    Обработка  результатов анализа. Концентрацию торка и его метаболита (X,

мг/л, мг/кг) рассчитывают по формуле:

 

                                       A

                                   X = -,

                                       P

 

где:

A - количество вещества, обнаруженное на хроматограмме, мкг;

P - объем (вода) или навеска (почва, растительный материал) исследуемой пробы, взятой для анализа, мл, г.

Требования безопасности. Следует соблюдать все необходимые меры безопасности при работе в химических лабораториях.