Утверждены

Минздравом СССР

8 июня 1989 г. N 5023-89

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ РИДОМИЛА В КАРТОФЕЛЕ, САХАРНОЙ СВЕКЛЕ,

ОГУРЦАХ, ТОМАТАХ, ЛУКЕ, ВИНОГРАДЕ, ВИНОГРАДНОМ СОКЕ, ТАБАКЕ,

ТАБАЧНОМ ДЫМЕ, ВОДЕ, ПОЧВЕ И БИОМАТЕРИАЛЕ МЕТОДАМИ

ГАЗОЖИДКОСТНОЙ И ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>

 

--------------------------------

<*> Разработаны: Л.И. Лещинской, К.Ф. Новиковой (ВНИИХСЗР) [1]; Ю.А. Бунатян, Л.Г. Мурадян (Филиал ВНИИГИНТОКС) [2]; Т.Н. Ипатовой, Г.А. Горкун (Филиал ВИЗР), Р.С. Горштейн (ВНИФС) [3]; Г.К. Васильевой, Т.В. Макаровой, В.П. Сухопаровой, Б.П. Стрекозовым, Н.В. Перфиловой (ИПФ АН СССР) [4]; Т.А. Пережогиной (ВИТИМ) [5]; Т.М. Петровой (ВИЗР) [6]; Э.В. Тводчрелидзе (ГрузНИИЗР) [7].

 

Взамен N 2426-81 от 06.08.81.

 

    Краткая      характеристика     препарата.      Ридомил    -    рацемат

N-(2,6-диметилфенил)-N-(метоксиацетил)аланина  метиловый эфир. Общепринятое

название  -  металаксил.  Брутто  -  формула C  H  NO .  Молекулярная масса

                                              15 21  4

279,34. Действующее вещество - кристаллы белого цвета с т. пл.  71 - 72 °C.

Летучесть при 20 °C 0,003 мг/куб. м.  Растворимость в воде при 20 °C 0,71%.

Хорошо  растворим  в  большинстве  органических растворителей. Устойчив при

хранении.  МДУ  ридомила (мг/кг):  в томатах,  огурцах - 0,5, луке, свекле,

картофеле - 0,05,  винограде - 0,03, сухом хмеле - 5, табаке - 1. Ридомил -

специфический  системный  фунгицид  избирательного  действия  для  борьбы с

фитофторозом картофеля,  томатов, милдью виноградной лозы, ложной мучнистой

росой и корнеедом овощных культур и сахарной свеклы, болезнями табака.

Принцип метода. Метод основан на извлечении ридомила из сельскохозяйственной продукции и воды этилацетатом, из увлажненной почвы и зеленой массы растений - смесью ацетона с этилацетатом, из табака - этиловым спиртом, из биоматериала - гексаном или хлороформом; очистке экстракта хроматографией на колонке с оксидом алюминия (экстрактов табака - на колонке с силикагелем) или микросублимацией в вакууме и определении газожидкостной или тонкослойной хроматографией.

Метрологическая характеристика метода. Минимально детектируемое количество при использовании метода ГЖХ зависит от характеристики детектора и колеблется в пределах 0,5 - 10 нг. При использовании метода ТСХ минимально детектируемое количество зависит от применяемого проявителя: при проявлении о-толидином - 0,5 мкг, альфа-нафтолом - 2 мкг, бромфеноловым синим - 0,2 мкг, йод-крахмальным проявителем - 5 мкг. Остальные метрологические параметры представлены в таблице 79.

 

Таблица 79

 

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ РИДОМИЛА

 

┌─────────────────────┬─────────────┬─────────┬─────────────┬─────────────┐

│Анализируемый объект │  Диапазон   │Предел   │   Среднее   │Доверительный│

│                     │ измеряемых  │обнару-  │  значение   │  интервал   │

│                     │концентраций,│жения,   │ определения │  среднего   │

│                     │    мг/кг    │нг (ГЖХ),│при n = 15, %│ определения │

│                     │  или мг/л   │мкг (ТСХ)│             │ при n = 5,  │

│                     │             │         │             │ p = 0,95, % │

├─────────────────────┴─────────────┴─────────┴─────────────┴─────────────┤

│                                   ГЖХ                                   │

│                                                                         │

│Картофель [1]        │0,04 - 4,00  │4        │87,9 +/- 8,0 │+/- 9,9      │

│Сахарная свекла [1]  │0,04 - 4,00  │4        │84,8 +/- 7,5 │+/- 9,3      │

│Огурцы [1]           │0,04 - 4,00  │4        │83,6 +/- 10,3│+/- 12,8     │

│Томаты [1]           │0,04 - 4,00  │4        │83,2 +/- 9,2 │+/- 11,5     │

│Табак [5]            │0,05 - 4,00  │10       │85,0 +/- 5,3 │+/- 6,4      │

│Почва [6]            │0,01 - 0,05  │1        │9,30 +/- 1,6 │+/- 2,0      │

│Вода [1]             │0,002 - 0,100│4        │81,1 +/- 7,3 │+/- 9,1      │

│Почва [4]            │0,05 - 4,0   │4        │84,3 +/- 9,7 │+/- 12,1     │

│                                                                         │

│                                   ТСХ                                   │

│                                                                         │

│Картофель [1]        │0,2 - 16,0   │0,5      │78 +/- 7     │+/- 9        │

│Сахарная свекла [1]  │0,2 - 16,0   │0,5      │78 +/- 6     │+/- 8        │

│Огурцы [1]           │0,2 - 16,0   │0,5      │85 +/- 8     │+/- 10       │

│Томаты (1]           │0,2 - 16,0   │0,5      │81 +/- 4     │+/- 5        │

│Лук [1]              │0,4 - 16,0   │0,5      │75 +/- 4     │+/- 5        │

│Листья винограда [7] │0,25 - 1,0   │5        │77 +/- 4     │+/- 10       │

│Виноградный сок [7]  │0,35 - 1,0   │5        │79 +/- 5     │+/- 15       │

│Вода [1]             │0,002 - 0,08 │0,5      │79 +/- 7     │+/- 9        │

│Почва [1]            │0,1 - 32,0   │0,5      │80 +/- 8     │+/- 10       │

│Почва [3]            │0,05 - 2,0   │0,5      │84 +/- 9     │+/- 11       │

│Биообъекты [2]:      │             │         │             │             │

│  кровь              │1,0 - 4,0    │1        │81 +/- 11    │+/- 5        │

│  легкие             │1,0 - 4,0    │1        │77 +/- 10    │+/- 5        │

│  селезенка          │1,0 - 4,0    │1        │80 +/- 10    │+/- 5        │

│  сердце             │1,0 - 4,0    │1        │77 +/- 10    │+/- 5        │

│  почки              │1,0 - 4,0    │1        │72 +/- 10    │+/- 5        │

│  печень             │1,0 - 4,0    │1        │78 +/- 8     │+/- 4        │

│  мозг               │1,0 - 4,0    │1        │69 +/- 10    │+/- 5        │

│  моча               │1,0 - 4,0    │1        │76 +/- 8     │+/- 4        │

│  кал                │1,0 - 4,0    │1        │71 +/ 11     │+/- 5        │

└─────────────────────┴─────────────┴─────────┴─────────────┴─────────────┘

 

Избирательность метода. Определению методом ГЖХ на колонках I и II мешают, а на колонке III не мешают симм-триазиновые гербициды. ФОП, в том числе метафос и карбофос, не мешают определению методами ГЖХ и ТСХ. Симм-триазиновые гербициды при определении ридомила методом ТСХ также не мешают.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием селективных детекторов, неподвижных фаз различной полярности при ГЖХ и различных систем подвижных растворителей и проявляющих систем при ТСХ, а также сочетанием методов ГЖХ и ТСХ.

Реактивы и растворы. Ацетон. Хлороформ свежеперегнанный. Бензол. н-Гексан. Этилацетат. Спирт этиловый, ректиф. Диэтиловый эфир х.ч., свежеперегнанный. Хлорид натрия. Сульфат натрия безводный х.ч. Оксид алюминия II степени активности по Брокману, нейтральный (производство фирмы Лахема или отечественный) для хроматографии [1, 2]. Силикагель (100 - 250 меш). Силикагель перед использованием высушивают в течение 4 ч при температуре 140 °C и переносят в склянку с притертой пробкой. К остывшему силикагелю осторожно, при непрерывном перемешивании добавляют 20 мл 0,005 н HCl на каждые 80 г силикагеля. После тщательного перемешивания содержимого колбы силикагель выдерживают в течение 48 ч для равномерного распределения кислоты. Подготовленный таким образом силикагель хранят в склянке с притертой пробкой [5]. Активированный уголь [7]. Хлороводородная кислота х.ч., 10-процентный раствор и концентрированная. Гидроксид калия, 4 н. Гидроксид натрия, 10 н. о-толидин. альфа-Нафтол. Натрий углекислый, кислый. Йодистое кали, 1-процентный раствор. Крахмал растворимый, 3-процентная суспензия в воде. Уксусная кислота, 1,5-процентный раствор. Перманганат калия, 1,5-процентный раствор. Нитрит натрия. Нитрат серебра. Бромфеноловый синий. Лимонная кислота, 2-процентный водный раствор.

Проявляющие реагенты. N 1: растворяют 0,16 г о-толидина в 30 мл ледяной уксусной кислоты, доводят объем до 500 мл дистиллированной водой и прибавляют 1 г KJ. Раствор хранят в темной склянке. Годен к употреблению в течение длительного времени. На каждое определение расходуют 3 - 5 мл проявляющего реагента [1, 2];

N 2: состоит из двух растворов. Для приготовления раствора а в 46 мл дистиллированной воды добавляют 4 мл концентрированной HCl и 1 г нитрита натрия. Для приготовления раствора б растворяют 2,8 г KOH в 50 мл дистиллированной воды и добавляют 0,1 г альфа-нафтола. Растворы а и б хранят не дольше 2 дней [1];

    N 3: смешивают в пропорции 9:1  0,5-процентный водно-ацетоновый раствор

AgNO   (соотношение воды и ацетона 1:3) и 0,5-процентный ацетоновый раствор

    3

бромфенолового синего. Готовят перед применением [3];

N 4: смесь равных объемов 1-процентного KJ и 3-процентной суспензии крахмала [2, 7].

Хромосорб W (100 - 120 меш). Хроматон N-AW-HMDS (0,20 - 0,16 мм). Карбовакс 20 М (полиэтиленгликоль 20000). Метилвинилсиликон E-31. Хроматон N-AW-DMCS (0,20 - 0,25 мм) с 5% XE-60. Газ-хром Q, силанизированный (0,16 - 0,18 мм) с 3% карбовакса 20 М. Хроматон N-супер (0,20 - 0,25 мм) с 3% OV-225. Хроматон N-AW-DMCS (0,16 - 0,20 мм) с 3% OV-1. Газообразный азот особый чистоты или газообразный гелий в баллонах с редуктором. Водород из баллона или получаемый из генератора водорода. Воздух из баллона с редуктором или нагнетаемый компрессором. Пластинки хроматографические "Силуфол". Стандартные растворы ридомила в ацетоне с концентрацией 100; 10 и 1 мкг/мл. Стандартные растворы стабильны при хранении в холодильнике в течение 6 мес.

Приборы и посуда. Хроматограф "Цвет-106" с ТИД и ДЭЗ или аналогичный прибор. Хроматографические колонки стеклянные длиной 1,1 м с внутренним диаметром 3,5 мм; 1,2 м и 4 мм; 1,1 м и 3,0 мм; 1 м и 3 мм. Хроматографические камеры с пришлифованными крышками. Камера для хлорирования - эксикатор вместимостью не менее 2 л. Механический встряхиватель. Ротационный вакуумный испаритель. Делительные воронки вместимостью 1500 мл. Колбы: круглодонные вместимостью 500 и 50 мл; плоскодонные вместимостью 250 мл; мерные на 100 мл; грушевидные на 50 мл. Цилиндры мерные. Пипетки вместимостью 10 и 1 мл с делениями. Чашки Петри. Лампа УФ-света медицинская (или аналогичная). Вакуумный сублиматор (см. рис. 1 - не приводится). Микрошприцы на 10 и 100 мкл стеклянные или микропипетка на 0,1 мл. Стеклянные пульверизаторы. Стеклянные хроматографические колонки с краном и оттянутым носиком длиной 10 см с внутренним диаметром 1 см (колонка I) [1]; длиной 20 см с внутренним диаметром 1,6 см (колонка II) [2, 3]; длиной 50 см с внутренним диаметром 2 см (колонка III) [5]. Воронка Бюхнера. Почвенное сито. Курительная машина.

Подготовка к определению. Хроматографические камеры перед началом хроматографирования на 1 ч заполняют смесью подвижных растворителей гексан-ацетон (2:1) [1, 2], бензол-этилацетат (4:5) [1], толуол-этилацетат-ацетон (40:40:10) [3] или этилацетат-уксусная кислота (95:5) [7].

Уровень подвижного растворителя в камере не должен быть выше, чем 0,7 - 1,0 см от дна камеры.

В стеклянную хроматографическую колонку I с краном помещают ватный тампон, затем заполняют ее смесью 4 г оксида алюминия в 10 мл гексана при открытом кране. Избыток растворителя сливают, оставляя слой 1 - 2 мм над поверхностью сорбента. Кран закрывают [1]. В стеклянную хроматографическую колонку II насыпают оксид алюминия; перед нанесением пробы смачивают н-гексаном [3].

Хроматографическую колонку III заполняют 15 г силикагеля, поверх сорбента вносят сульфат натрия слоем 1,5 - 2 см, промывают колонку 50 мл гексана [5].

    Камеру для хлорирования готовят  следующим  образом:  на дно эксикатора

помещают  чашку  Петри с 5 г  KMnO ,  затем  к  ее  содержимому   осторожно

                                  4

приливают  15  мл  концентрированной HCl.  Камеру  закрывают пришлифованной

крышкой. Камера может быть использована через 5 - 10 мин. [1, 2, 7].

Подготовка проб к анализу. Для анализа картофеля, сахарной свеклы из отдельных клубней или корнеплодов средней пробы вырезают секторы толщиной 2 - 3 мм и измельчают на мелкие кусочки с размером граней не более 0,5 см. Лук шинкуют. Томаты и огурцы измельчают ножом на мелкие дольки, предварительно вырезав из каждого плода узкий сегмент. Подготавливают по 3 - 5 параллельных навесок анализируемых образцов массой по 25 г. Почву просеивают через почвенное сито и отбирают навески массой 10 г. Листья, побеги винограда пропускают через мясорубку, отбирают навески массой 20 г. Все плоды должны быть свежими, лук не должен быть проросшим.

Ход анализа. Экстракция. Навеску анализируемой пробы картофеля, сахарной и столовой свеклы, огурцов, томатов, винограда [1] массой 25 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 500 мл, заливают 100 мл этилацетата и проводят экстракцию ридомила механическим встряхиванием колбы в течение 30 мин. Экстракт фильтруют в плоскодонную колбу вместимостью 250 мл. Еще дважды повторяют операцию, используя по 75 мл растворителя. Этилацетат из экстракта удаляют порциями с помощью ротационного вакуумного испарителя, следы растворителя удаляют полностью. К сухому остатку добавляют 2 - 3 мл гексана и проводят очистку на колонке I с оксидом алюминия или с помощью микросублимации в вакууме.

Навеску лука [1] массой 25 г помещают в плоскодонную колбу на 500 мл, добавляют около 2 мл 4 н KOH до pH среды 8 и проводят экстракцию так же, как из картофеля и свеклы. Экстракты очищают микросублимацией в вакууме.

Навеску табака [5] массой 10 г помещают в колбу Эрленмейера на 250 мл и экстрагируют ридомил 100 мл этилового спирта с помощью механического встряхивания колбы в течение 1 ч. Экстракт фильтруют через воронку Бюхнера, остаток на фильтре промывают 4 раза этиловым спиртом порциями по 5 мл. К объединенному в делительной воронке фильтрату добавляют 150 мл 5-процентного раствора хлорида натрия и трижды экстрагируют ридомил хлороформом порциями по 75 мл. Объединенный хлороформный экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия и с помощью ротационного вакуумного испарителя полностью отгоняют растворитель. Сухой остаток растворяют в 5 мл гексана. Далее экстракт очищают на колонке III с силикагелем.

Конденсат табачного дыма [5], собранный в электростатической ловушке, вымывают этиловым спиртом 4 раза порциями по 20 мл. Дальнейшую экстракцию проводят так же, как из пробы табака.

Из 20 мл виноградного сока [7] трижды экстрагируют ридомил хлороформом порциями по 50 мл. Объединенный экстракт сушат над безводным сульфатом натрия. Окрашенные экстракты очищают активированным углем.

Листья и побеги виноградной лозы [7] массой соответственно 20 и 40 г замораживают с помощью жидкого азота (можно пропустить через мясорубку) и измельчают до порошкообразного состояния. Измельченные образцы помещают в колбу Эрленмейера с притертой пробкой на 250 мл и добавляют 50 мл хлороформа. Полученную смесь встряхивают на аппарате дли встряхивания в течение 30 мин. Экстракт отфильтровывают бумажным фильтром. Экстракцию ридомила повторяют еще два раза. Экстракты объединяют, высушивают безводным сульфатом натрия, промывают хлороформом и при температуре 40 °C упаривают до сухого остатка.

Для экстракции препарата из почвы применяют три способа.

I способ экстракции [1]. К 10 г почвы, растертой в фарфоровой ступке, добавляют 10 мл дистиллированной воды. Экстракцию ридомила проводят этилацетатом трижды порциями по 75 мл при механическом встряхивании колбы в течение 30 мин. Дальнейшие операции и очистку экстракта проводят так же, как из пробы картофеля и свеклы. При очистке экстракта на колонке с оксидом алюминия берут пробу почвы массой 10 г. При очистке экстракта микросублимацией в вакууме массу пробы можно увеличить до 20 г. При определении остатков ридомила методом ТСХ следует использовать очистку только с помощью микросублимации в вакууме пробы почвы массой 10 г.

II способ экстракции из почвы с большим содержанием гумуса [3]. Навеску почвы 50 г помещают в колбу вместимостью 200 - 300 мл, увлажняют 50 мл дистиллированной воды (если почва сухая, оставляют на 30 мин.), затем добавляют 50 мл ацетона и 20 мл этилацетата. Экстракцию ридомила проводят с помощью механического встряхивания колбы в течение 30 мин. Экстракт фильтруют через воронку Бюхнера, остаток на фильтрате дважды промывают ацетоном порциями по 15 - 20 мл. Объединенный фильтрат концентрируют с помощью ротационного вакуумного испарителя. Из водного остатка ридомил трижды экстрагируют хлороформом порциями по 20 мл. Объединенный экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу на 100 мл и с помощью ротационного вакуумного испарителя полностью отгоняют растворитель. Сухой остаток растворяют в 0,5 мл ацетона. Далее проводят очистку хроматографией на колонке II с оксидом алюминия.

    III способ  экстракции  почвы  [4, 6].  Просеянную через почвенное сито

почву   массой   100 г  заливают  130 мл смеси  ацетон-гексан-0,05 н  CaCl

                                                                          2

50:50:30 мл)  и  экстрагируют  ридомил с помощью механического встряхивания

колбы в течение суток. Пробы фильтруют, остаток дважды промывают на фильтре

ацетоном  порциями  по  15 - 20 мл.  Из объединенного экстракта отгоняют на

ротационном  вакуумном  испарителе  органическую  фазу.  К  водному остатку

добавляют  30 мл  0,1  н  HCl и полученный  раствор фильтруют в делительную

воронку.  Колбу еще дважды промывают 0,1 н  HCl  порциями по 15 мл. Раствор

объединяют.     Экстракт    очищают    перераспределением    между    двумя

несмешивающимися жидкостями.

Пробу воды объемом 1 л помещают в делительную воронку вместимостью 1,5 л, добавляют 5 - 7 г хлорида натрия и 100 мл этилацетата, насыщенного водой. Смесь в течение нескольких минут энергично встряхивают. После разделения слоев нижний слой переносят в другую делительную воронку, а верхний этилацетатный слой сливают в плоскодонную колбу вместимостью 250 мл. Экстракцию ридомила проводят еще два раза этилацетатом порциями по 75 мл. Объединенный этилацетатный экстракт сушат над безводным сульфатом натрия (10 - 12 г), а затем порциями фильтруют в круглодонную колбу на 50 мл. Каждую порцию фильтрата концентрируют на ротационном вакуумном испарителе до объема 1 - 2 мл. Из последней порции фильтрата растворитель удаляют полностью. При определении ридомила методом ГЖХ к сухому остатку пипеткой добавляют 1 мл гексана и далее вводят в хроматограф 4 мкл полученного раствора. При определении методом ТСХ экстракт очищают на колонке I с оксидом алюминия или микросублимацией в вакууме (так же, как экстракты из картофеля и свеклы).

Пробу крови или мочи [2] объемом 5 мл помещают в коническую колбу с притертой пробкой, заливают 30 мл хлороформа, 2 - 3 мин. перемешивают и оставляют на 3 - 4 ч. Затем органический слой отделяют и сливают через безводный сульфат натрия в колбу для выпаривания. Экстракцию оставшегося биосубстрата в колбе повторяют еще дважды хлороформом порциями по 20 мл. Объединенный экстракт выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани 30 - 35 °C досуха и количественно переносят гексаном на пластинку "Силуфол".

Пробу кала [2] массой 5 г помещают в коническую колбу на 100 мл, заливают 50 мл хлороформа, перемешивают 2 - 3 мин. и оставляют на 3 - 4 ч. Затем хлороформ осторожно сливают через фильтр "синяя лента" в колбу для отгонки растворителя. Экстракцию хлороформом повторяют еще дважды порциями по 30 мл. Объединенный экстракт упаривают с помощью ротационного вакуумного испарителя при температуре 30 - 35 °C досуха. Сухой остаток с колбы смывают трижды порциями по 2 мл 2-процентным раствором едкого натра и переносят в делительную воронку на 100 мл. Из водной фазы ридомил осторожно (во избежание образования эмульсии) экстрагируют хлороформом. Собранный хлороформный экстракт несколько раз промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции последней. Растворитель сушат безводным сульфатом натрия и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30 - 35 °C досуха. Сухой остаток количественно переносят на пластинку "Силуфол" для дальнейшего хроматографирования.

Навеску органов животного (легкие, сердце, печень, селезенка, почки, мозг [2]) массой 5 г тщательно измельчают ножницами, помещают в колбу с притертой пробкой, заливают 30 мл гексана и оставляют на ночь в холодильнике. На следующий день сливают гексан через слой безводного сульфата натрия в колбу для отгонки растворителя. Пробу экстрагируют еще дважды гексаном порциями по 30 мл встряхиванием в течение 5 - 10 мин. Объединенные экстракты выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30 - 35 °C досуха. Сухую колбу трижды тщательно ополаскивают 3 мл 0,1 н раствора серной кислоты. Затем смыв нейтрализуют 0,1 н раствором едкого натра. Из водной фазы ридомил трижды перераспределяют в органическую экстракцией 30 мл гексана. Гексановый слой отделяют и сливают через безводный сульфат натрия в колбу для отгонки растворителя. Собранные экстракты выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при 30 - 35 °C досуха. Сухой остаток количественно переносят на пластинку "Силуфол" гексаном для последующего хроматографирования.

Очистка экстракта. Существует 6 способов очистки экстракта.

Очистка на колонке I с оксидом алюминия [1]. Экстракты из картофеля, сахарной и столовой свеклы, винограда, а также экстракт из почвы, подготовленный по способу I, очищают на колонке I с оксидом алюминия. Колонку готовят следующим образом. В колонку I (10 x 1 см) помещают ватный тампон, затем заполняют ее смесью 4 г оксида алюминия и 10 мл гексана при открытом кране. Избыток растворителя сливают, оставляя слой 1 - 2 мм над поверхностью сорбента. При закрытом кране переносят на колонку сконцентрированный экстракт, затем кран колонки открывают, дают возможность экстракту впитаться в сорбент, не допуская при этом полного впитывания растворителя в сорбент (слой растворителя не должен быть ниже, чем 2 - 3 мм над поверхностью носителя колонки). Стенки колбочки несколько раз обмывают гексаном (общим объемом 2 мл) и полученные растворы порциями переносят на колонку. Фунгицид элюируют с колонки 10 мл хлороформа со скоростью 1 капля в секунду в грушевидную колбу на 20 мл. Равномерность скорости элюирования обеспечивается с помощью слабого вакуума. Из грушевидной колбы с помощью ротационного вакуумного насоса полностью отгоняют растворитель. К сухому остатку пипеткой добавляют 1 мл гексана, колбу закрывают пробкой на шлифе и ее стенки тщательно обмывают растворителем. Определение ридомила в подготовленной пробе проводят методом ГЖХ или ТСХ.

Очистка на колонке II с оксидом алюминия [3]. Экстракт почвы с большим содержанием гумуса, подготовленный по способу II, очищают на колонке II (20 x 1,6 см), заполненной на высоту 10 см оксидом алюминия, смоченным 20 мл гексана. После удаления избытка растворителя на колонку переносят подготовленный экстракт, колбу дважды споласкивают гексаном порциями по 5 мл, дают возможность раствору впитаться в сорбент, затем элюируют ридомил 100 мл смеси гексана с диэтиловым эфиром (1:1). Из элюата полностью отгоняют растворитель. Сухой остаток растворяют в 0,5 мл ацетона и далее проводят определение ридомила методом ГЖХ или ТСХ.

Очистка на колонке III с силикагелем [5]. Экстракт из табака очищают на колонке с силикагелем. Хроматографическую колонку III (50 x 2 см) заполняют 15 г силикагеля, обработанного кислотой. Поверх слоя добавляют слой безводного сульфата натрия толщиной 1,5 - 2 см, промывают колонку 50 мл гексана и вносят табачный экстракт. Колбу с экстрактом трижды промывают гексаном порциями по 5 мл и тоже вносят в колонку каждый раз после того, как мениск предыдущего раствора достигнет поверхности сульфата натрия. Промывают колонку 100 мл гексана, а затем элюируют ридомил 100 мл смеси гексана с диэтиловым эфиром (1:1). Из полученного элюента полностью отгоняют растворитель. К сухому остатку добавляют 2 - 5 мл гексана и далее проводят определение ридомила методом ГЖХ.

Очистка экстрактов микросублимацией в вакууме [1]. Очистку экстрактов картофеля, свеклы, огурцов, томатов, винограда, лука, а также экстрактов почвы, полученных способом I, можно проводить с помощью микросублимации в вакууме. Для этого экстракт концентрируют на ротационном вакуумном испарителе до объема примерно 5 мл, остаток количественно переносят в патрон сублиматора и после удаления растворителя на горячей водяной бане сублимируют ридомил при температуре 85 - 95 °C, давлении 73,3 Па (0,55 мм рт. ст.) в течение 30 мин. (экстракты из томатов сублимируют в течение 45 мин.). После окончания сублимации ридомил смывают с "пальца" сублиматора 10 мл гексана в грушевидную колбу вместимостью 20 мл. На ротационном вакуумном испарителе полностью удаляют растворитель. К сухому остатку пипеткой добавляют 1 мл гексана, колбу закрывают пробкой на шлифе и ее стенки тщательно обмывают растворителем. Определение ридомила в подготовленной пробе проводят методом ГЖХ или ТСХ.

Очистка активированным углем [7]. В экстракт из виноградного сока, листьев или побегов виноградной лозы добавляют 3 - 5 г мелкоизмельченного активированного угля и содержимое колбы в течение 30 мин. - 1 ч периодически встряхивают. Обесцвеченный экстракт фильтруют через бумажный фильтр, остаток промывают гексаном. Из полученного фильтрата полностью отгоняют растворитель. Сухой остаток растворяют в 1 - 2 мл гексана. Далее определение проводят методом ТСХ и ГЖХ.

Очистка перераспределением из одной системы растворителей в другую. Для очистки почвенного экстракта, полученного способом III, в делительную воронку добавляют 10 н NaOH до pH 10 и трижды экстрагируют ридомил хлороформом порциями по 25 мл. Хлороформный экстракт сушат над безводным сульфатом натрия и полностью отгоняют растворитель. К сухому остатку пипеткой добавляют 5 мл гексана. Далее проводят определение ридомила методом ГЖХ.

Чтобы очистить экстракт листьев и побегов виноградной лозы, сухой остаток растворяют в холодной смеси ацетона с водой (2:1) и в течение 30 мин. выдерживают на холоде. После этого экстракт отфильтровывают, промывают холодной смесью ацетон-вода. Из фильтрата выпаривают ацетон на ротационном испарителе при температуре 40 °C. Из водного раствора ридомил экстрагируют гексаном. Если получился подкрашенный экстракт, к нему добавляют 3 - 5 г мелкоизмельченного активированного угля и оставляют на 30 мин. - 1 ч (при этом колбу периодически встряхивают). Обесцвеченный экстракт фильтруют через бумажный фильтр, остаток промывают гексаном, после чего экстракт концентрируют до объема около 0,05 мл. Далее проводят определение методом ТСХ.

Условия хроматографирования при использовании метода ГЖХ (с ТИД, ДЭЗ). Применяют следующие насадки для колонок:

колонка I - 3% карбовакса 20 М на хроматоне N-AW-HMDS (0,20 - 0,25 мм) [1];

колонки II, III, VII и VIII - 5% XE-60 на хроматоне N-AW-DMCS (0,20 - 0,25 мм) [1, 2, 4, 7];

колонка IV - 5% E-31 на хромосорбе W (0,100 - 120 мм) [1];

колонка V - 3% карбовакса 20 М на газ-хроме Q (0,16 - 0,18 мм) [5];

колонка VI - 3% OV-225 на хроматоне N-супер (0,20 - 0,25 мм) [2];

колонка IX - 3% OV-1 на хроматоне N-AW-DMCS (0,16 - 0,20 мм) [4].

Конкретные параметры работы зависят от применяемого прибора. В таблице 80 приведены условия хроматографирования на приборе "Цвет-106" с ТИД и ДЭЗ.

 

Таблица 80

 

УСЛОВИЯ ХРОМАТОГРАФИРОВАНИЯ

 

┌────────────┬──────────────────────────────────────────────────────────────────────────────┐

│ Параметры  │                                Номер колонки                                 │

│            ├─────────┬─────────┬───────┬─────────┬───────┬───────┬───────┬────────┬───────┤

│            │    I    │   II    │  III  │   IV    │   V   │  VI   │  VII  │  VIII  │  IX   │

├────────────┼─────────┼─────────┼───────┼─────────┼───────┼───────┼───────┼────────┼───────┤

│Размеры     │110 x 3,5│110 x 3,5│110 x 3│120 x 3,5│100 x 3│100 x 3│180 x 3│100 x 3 │100 x 3│

│колонок     │         │         │       │         │       │       │       │        │       │

│(длина x    │         │         │       │         │       │       │       │        │       │

│внутренний  │         │         │       │         │       │       │       │        │       │

│диаметр), см│         │         │       │         │       │       │       │        │       │

│Температура,│         │         │       │         │       │       │       │        │       │

│°C:         │         │         │       │         │       │       │       │        │       │

│  колонки   │190      │230      │210    │190      │210    │180    │190    │170     │180    │

│  испарителя│200      │230      │230    │200      │230    │240    │240    │225     │250    │

│  детектора │-        │-        │-      │-        │-      │-      │-      │280     │280    │

│Скорость,   │         │         │       │         │       │       │       │        │       │

│мл/мин.:    │         │         │       │         │       │       │       │        │       │

│  азота     │75       │40       │26     │75       │40     │25     │25     │60      │60     │

│  H         │12 - 15  │12 - 15  │26     │13 - 14  │40     │15 - 18│20     │-       │-      │

│   2        │         │         │       │         │       │       │       │        │       │

│  воздуха   │400      │400      │240    │400      │400    │170    │400    │-       │-      │

│Скорость    │240      │240      │240    │240      │240    │240    │240    │240     │240    │

│протяжки    │         │         │       │         │       │       │       │        │       │

│диаграммной │         │         │       │         │       │       │       │        │       │

│ленты,      │         │         │       │         │       │       │       │        │       │

│мм/мин.     │         │         │       │         │       │       │       │        │       │

│Линейный    │4 - 160  │4 - 160  │1 - 26 │4 - 160  │1 - 25 │1 - 25 │10     │0,5 - 50│1 - 5  │

│диапазон    │         │         │       │         │       │       │       │        │       │

│детектиро-  │         │         │       │         │       │       │       │        │       │

│вания, нг   │         │         │       │         │       │       │       │        │       │

│Время       │3 мин.   │2 мин.   │-      │3 мин.   │1 мин. │10 мин.│7 мин. │1 мин.  │2 мин. │

│удерживания │51 с     │15 с     │       │58 с     │38 с   │6 с    │       │30 с    │20 с   │

└────────────┴─────────┴─────────┴───────┴─────────┴───────┴───────┴───────┴────────┴───────┘

 

    Примечание. У  ТИД  объем  вводимой  пробы  2  мкл,  шкала электрометра

      -10                                        -12

2 x 10    А;  у ДЭЗ соответственно 5 мкг и 2 x 10    А. На колонках I - VII

определение проводят с ТИД, на колонках VIII, IX - с ДЭЗ.

 

Количественное определение проводят методом соотношения со стандартом по высоте пиков при работе с ТИД и методом абсолютной калибровки по градуировочному графику при работе с ДЭЗ.

    Метод ТСХ.  Для определения  остаточных количеств ридомила тонкослойной

хроматографией  аликвотную часть экстракта, очищенного на колонках I - III,

а также  микросублимацией в вакууме и активированным  углем (50 - 100 мкл),

с  помощью  микрошприца  наносят  на  пластинку  "Силуфол". При определении

остаточных количеств ридомила в луке на пластинку следует наносить аликвоту

50 мкл.  Экстракты  биообъектов  (крови, мочи, кала, органов животных)  [2]

наносят  на  пластинку  полностью.  По бокам от рабочей  пробы микрошприцем

наносят  серию  стандартных  растворов ридомила 5; 10; 20; 30; 40 мкл,  что

составляет  0,5;  1;  2;  3  и  4  мкг  фунгицида.   Пластинку  помещают  в

хроматографическую  камеру  и  развивают  хроматограмму в системе подвижных

растворителей  гексан-ацетон  (2:1) [1, 2] или бензол-этилацетат (4:5) [1].

После  развития  хроматограммы высушенную пластинку на 20 мин. помещают под

УФ-лампу,  а  затем на 5 мин.  в  камеру  для хлорирования.  После удаления

избытка   хлора  пластинку   обрабатывают  из  пульверизатора   проявляющим

реагентом  N 1  (о-толидиновым   проявителем).   Ридомил   проявляется   на

пластинках  в  виде  синих пятен на белом фоне с R  0,47 +/- 0,02  в первой

                                                  f

системе  подвижных  растворителей  и  R  0,35 +/- 0,02 - во  второй.  Пятна

                                       f

стабильны  в  течение  5 - 8  мин.,   затем  пластинка  начинает   темнеть.

Линейность   определения   сохраняется  в  пределах   0,5 - 4 мкг.   Вместо

о-толидина   в  качестве проявителя можно использовать смесь равных объемов

1-процентного раствора KI и 3-процентной суспензии крахмала [2, 7]. Ридомил

проявляется на пластинке в виде  темно-голубых  пятен с линейным диапазоном

определения 5 - 20 мкг.

При проявлении хроматограмм проявляющим реагентом N 2 (альфа-нафтолом) [1] пластинку обрабатывают раствором а, затем раствором б. Ридомил проявляется в виде розовых пятен на белом фоне. Пятна стабильны в течение длительного времени. Линейность определения сохраняется в пределах 2 - 8 мкг.

    В   качестве   альтернативных    могут   быть   использованы    системы

толуол-этилацетат-ацетон  (4:4:1)  [3] и этилацетат-уксусная кислота (95:5)

[7],   а  для   проявления  хроматограмм  пластинки  обрабатывают   сначала

проявляющим реагентом N 3, а затем 2-процентным раствором лимонной кислоты.

В этом случае ридомил проявляется на хроматограммах в виде бледно-сиреневых

пятен на ярко-желтом фоне с R  0,46 +/- 0,02 в первой системе и R  0,63 +/-

                             f                                   f

0,02 - во второй. Линейный диапазон определения 0,2 - 5,0 мкг.

Обработка результатов анализа. Содержание ридомила в анализируемой пробе (X, мг/кг или мг/л) при определении методом ГЖХ с ТИД вычисляют по формуле:

 

                                   С  H  V

                                    ст рп

                               X = -------,

                                   H  V P

                                    ст а

 

    где:

    C   - масса стандарта ридомила, введенного в хроматограф, нг;

     ст

    H   - высота пика рабочей пробы, мм;

     рп

    H   - высота пика стандарта, мм;

     ст

    V - общий объем рабочего раствора, мл;

    V  - объем аликвоты, вводимой в хроматограф, мкл;

    P - навеска анализируемого образца или объем пробы воды, г, мл.

    При определении  методом ГЖХ с ДЭЗ содержание  ридомила рассчитывают по

формуле:

 

                                     AV

                                 X = ---,

                                     V P

                                      а

 

    где:

    A - количество  ридомила,   найденное  по  градуировочному   графику  в

хроматографируемой пробе, нг;

    V, V  и P - те же показатели, что и в предыдущей формуле.

        а

Если при введении в хроматограф получаются слишком большие пики или происходит "зашкаливание", в хроматограф вводят меньшие объемы рабочей пробы и стандартов или к рабочему раствору пипеткой добавляют известное количество гексана и хроматографируют разбавленный раствор.

При использовании метода ТСХ количественное определение ридомила в пробе проводят путем сравнения площади и интенсивности окраски пятен рабочей пробы и серии стандартных растворов.

Содержание ридомила в анализируемой пробе (X, мг/кг или мг/л) вычисляют по формуле:

 

                                     AV

                                 X = ---,

                                     V P

                                      а

 

    где:

    A - количество ридомила, найденное в хроматографируемой пробе, мкг;

    V - общий   объем  раствора,   из  которого   отбирают   аликвоту   для

хроматографирования, мл;

    V  - объем аликвоты, нанесенный на хроматографическую пластинку, мл;

     а

Р - навеска анализируемой пробы или объем пробы, г или мл.

Требования безопасности. Соблюдают правила безопасности, принятые для работы с легковоспламеняющимися жидкостями и пестицидами.